通過(guò)聯(lián)合代謝途徑工程和發(fā)酵條件優(yōu)化技術(shù)，增強(qiáng)Wolfiporia cocos（一種靈芝屬真菌）中的三萜類(lèi)化合物生物合成能力
《Journal of Industrial and Engineering Chemistry》：Enhanced triterpenoid biosynthesis in
Wolfiporia cocos through combined metabolic pathway engineering and fermentation condition optimization
編輯推薦：
通過(guò)過(guò)表達(dá) Wolfiporia cocos 的 farnesyl diphosphate synthase (FDPS) 和 squalene synthase (SQS) 基因增強(qiáng) MVA 途徑，結(jié)合玉米油補(bǔ)充和 Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，工程化真菌在 10 L 生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)三萜類(lèi)化合物（WCTs）產(chǎn)量達(dá) 53.3 mg/g 和 1252 mg/L，其中 pachymic acid、tumulosic acid 和 2,3-hydroxybetulinic acid 濃度分別為 2.51、52.1 和 21.2 mg/L，體外實(shí)驗(yàn)顯示對(duì) K562 和 L1210 白血病細(xì)胞抑制率超 60%。
陳天鵬|劉靜|唐晨敏|于斌|牛煥清|沙宇|孫文軍|陳勇|應(yīng)漢杰
中國(guó)南京工業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與制藥工程學(xué)院材料導(dǎo)向化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京211816
摘要
Wolfiporia cocos 三萜類(lèi)化合物（WCTs）是由傳統(tǒng)藥用和食用真菌Wolfiporia cocos產(chǎn)生的天然生物活性羊毛甾烷型三萜類(lèi)化合物。在本研究中，我們通過(guò)過(guò)表達(dá)法尼基二磷酸合成酶（FDPS）和角鯊烯合成酶（SQS）基因，將W. cocos改造為真菌細(xì)胞工廠(chǎng)，從而增強(qiáng)了甲羥戊酸途徑的表達(dá)。隨后，我們采用Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合玉米油補(bǔ)充優(yōu)化了發(fā)酵參數(shù)，使三萜類(lèi)化合物的含量達(dá)到42.6 mg/g。此外，在10升生物反應(yīng)器中的放大生產(chǎn)進(jìn)一步將WCTs的產(chǎn)量提高到53.3 mg/g和1252 mg/L，其中厚樸酸、木酮酸和2,3-羥基貝塔林酸的濃度分別達(dá)到了2.51 mg/L、52.1 mg/L和21.2 mg/L。此外，WCTs表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的體外抗腫瘤活性，能夠抑制K562和L1210白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)超過(guò)60%。總之，這些結(jié)果證明了工程化W. cocos的 submerged 發(fā)酵是一種生產(chǎn)生物活性三萜類(lèi)化合物的有效平臺(tái)，為開(kāi)發(fā)其他藥用和食用真菌作為高價(jià)值生物活性代謝產(chǎn)物的細(xì)胞工廠(chǎng)奠定了基礎(chǔ)并提供了實(shí)際參考。
引言
棕色腐朽真菌Wolfiporia cocos（同義詞Poria cocos）的菌核在東亞地區(qū)幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)一直被用作藥材和食用蘑菇[1]。在北美，W. cocos的食用菌核被稱(chēng)為“Tuckahoe”或“Indian bread”[2]。在傳統(tǒng)中醫(yī)框架下，W. cocos是“藥食同源”的典型例子，既可作為食物也可作為藥物用于預(yù)防和治療疾病[3]。三萜類(lèi)化合物是生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)最多樣化的特殊代謝物之一[4]。W. cocos 三萜類(lèi)化合物（WCTs）已被確認(rèn)為W. cocos的主要生物活性成分，具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用[5]、[6]。特別是厚樸酸（PA），作為一種羊毛甾烷型三萜類(lèi)化合物，被認(rèn)為是W. cocos菌核的主要活性成分，引起了特別關(guān)注[2]、[7]、[8]，這表明WCTs是開(kāi)發(fā)功能性食品和新療法的有吸引力的候選物質(zhì)。
在自然界中，W. cocos在Pinus屬植物的根部形成大型菌核，以松木中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[9]。然而，菌核的形成嚴(yán)重依賴(lài)于環(huán)境條件，而商業(yè)化栽培需要大量的松木，對(duì)森林資源和環(huán)境造成了很大壓力。先前的研究表明，submerged培養(yǎng)的菌絲體中的三萜類(lèi)化合物含量遠(yuǎn)高于菌核[10]。因此，為了克服自然環(huán)境和對(duì)松木的過(guò)度依賴(lài)，實(shí)現(xiàn)WCTs生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化及其未來(lái)的臨床應(yīng)用，submerged 發(fā)酵是一種可行的策略，因?yàn)樗哂袃?yōu)越的時(shí)空效率和批次穩(wěn)定性[11]。這些獨(dú)特特性為大規(guī)模生物合成生物活性三萜類(lèi)化合物提供了可能性。
目前，合成生物學(xué)的快速發(fā)展為提高微生物生產(chǎn)天然產(chǎn)物（包括萜類(lèi)化合物）提供了強(qiáng)大的工具，其基礎(chǔ)在于底盤(pán)細(xì)胞開(kāi)發(fā)、代謝工程和發(fā)酵工程[12]、[13]、[14]。食用和藥用真菌特別適合作為三萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的底盤(pán)，因?yàn)樗鼈兙哂刑烊坏妮祁?lèi)化合物生物合成基因簇、對(duì)產(chǎn)物的高耐受性以及多種輔酶系統(tǒng)，如細(xì)胞色素P450還原酶（圖1A）[15]、[16]、[17]、[18]。因此，利用食用和藥用真菌作為萜類(lèi)化合物生物合成的底盤(pán)菌株具有重要意義，這可以為開(kāi)發(fā)生物活性制劑提供更多的先導(dǎo)化合物。通常，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件[19]、添加外源物質(zhì)（如植物油、表面活性劑和誘導(dǎo)劑）來(lái)誘導(dǎo)萜類(lèi)化合物的合成[20]，以及調(diào)節(jié)甲羥戊酸（MVA）途徑和下游三萜類(lèi)分支的關(guān)鍵基因表達(dá)[21]，可以增強(qiáng)三萜類(lèi)化合物的生物合成。W. cocos中PA及相關(guān)羊毛甾烷型三萜類(lèi)化合物的生物合成途徑及其相關(guān)基因已被闡明[22]，提高了我們對(duì)這一物種中三萜類(lèi)化合物生物合成的理解。然而，關(guān)于W. cocos中高效三萜類(lèi)化合物生產(chǎn)的途徑工程和發(fā)酵優(yōu)化的系統(tǒng)整合研究卻很少。
在本研究中，我們使用W. cocos作為真菌細(xì)胞工廠(chǎng)來(lái)生產(chǎn)高價(jià)值的三萜類(lèi)化合物。首先，通過(guò)過(guò)表達(dá)關(guān)鍵的三萜類(lèi)化合物生物合成基因增強(qiáng)了MVA途徑。接下來(lái)，系統(tǒng)優(yōu)化了發(fā)酵條件，并篩選了植物油作為外源添加劑以進(jìn)一步提高submerged培養(yǎng)中的三萜類(lèi)化合物產(chǎn)量。最后，在10升生物反應(yīng)器中進(jìn)行了放大生產(chǎn)；通過(guò)HPLC-MS對(duì)所得菌絲體的三萜類(lèi)化合物組成進(jìn)行了分析，并評(píng)估了其對(duì)白血病細(xì)胞系的體外抗腫瘤活性。總體而言，這項(xiàng)工作為高效生物合成高價(jià)值生物活性三萜類(lèi)化合物提供了參考，并為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用食用和藥用真菌作為真菌細(xì)胞工廠(chǎng)奠定了基礎(chǔ)。
部分內(nèi)容摘要
菌株和培養(yǎng)條件
Wolfiporia cocos菌株CGMCC 5.78購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）。固體培養(yǎng)基為PDA，培養(yǎng)溫度為26℃。種子培養(yǎng)基含有20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、0.5 g/L KH2PO4和0.03 g/L MgSO42PO4、0.03 g/L MgSO4和0.1 g/L維生素B1，培養(yǎng)條件為25℃和160 rpm，接種量為5%。質(zhì)粒在
在W. Cocos中過(guò)表達(dá)FDPS和SQS的功能表征
FDPS是法尼基二磷酸合成酶，而SQS是角鯊烯合成酶。FDPS催化二甲基烯丙基-PP轉(zhuǎn)化為法尼基二磷酸，隨后SQS進(jìn)一步催化生成角鯊烯，這些都是三萜類(lèi)化合物生物合成的潛在分子靶點(diǎn)和關(guān)鍵酶[25]、[26]。為了探討FDPS和SQS在調(diào)節(jié)WCTs生物合成中的作用，我們繪制了MVA途徑（圖1A），并使用pBluescript SK質(zhì)粒過(guò)表達(dá)了FDPS和SQS（圖1B）。
結(jié)論
在本研究中，通過(guò)過(guò)表達(dá)法尼基二磷酸合成酶和角鯊烯合成酶，將W. cocos改造為真菌細(xì)胞工廠(chǎng)，并采用BBD結(jié)合玉米油補(bǔ)充優(yōu)化了發(fā)酵條件。在10升生物反應(yīng)器中，工程化菌株FDPS-2產(chǎn)生的三萜類(lèi)化合物含量達(dá)到53.3 mg/g和1252 mg/L，包括厚樸酸、木酮酸和2,3-羥基貝塔林酸。WCTs表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的體外抗腫瘤活性，能夠抑制K562和L1210白血病細(xì)胞
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
陳天鵬：撰寫(xiě) – 審稿與編輯，撰寫(xiě) – 原稿，數(shù)據(jù)可視化，項(xiàng)目管理，實(shí)驗(yàn)研究。劉靜：撰寫(xiě) – 原稿，數(shù)據(jù)分析。唐晨敏：方法學(xué)研究，數(shù)據(jù)管理。于斌：資源協(xié)調(diào)。牛煥清：項(xiàng)目管理。沙宇：項(xiàng)目管理。孫文軍：資金籌集。陳勇：監(jiān)督，資金籌集，概念構(gòu)思。應(yīng)漢杰：監(jiān)督，資金籌集，概念構(gòu)思。
資助
本研究得到了中國(guó)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFC2105400）、江蘇省先進(jìn)生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心（XTA2201）、材料導(dǎo)向化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（SKL-MCE-22A04）、江蘇省高等教育機(jī)構(gòu)自然科學(xué)基金（24KJB530014）、江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（BK20233003）、江蘇省優(yōu)秀博士后計(jì)劃（2024ZB495）等項(xiàng)目的支持。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒(méi)有已知的可能會(huì)影響本文所述工作的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系。
致謝
我們感謝武漢理工大學(xué)（中國(guó)武漢）的吳文軍副教授提供pBluescript SK質(zhì)粒，并指導(dǎo)質(zhì)粒構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化。同時(shí)感謝上海OE Biotech有限公司對(duì)傳統(tǒng)中藥組學(xué)的分析。
