《Journal of Translational Autoimmunity》：A novel epigenetic regulation of JAM-A by EZH2-DNMT3A cascade contributes to T cell adhesion via the activation of Rap1a in lupus patients
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本研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者T細胞中，EZH2/H3K27me3通過抑制DNMT3A表達，降低JAM-A啟動子區(qū)甲基化水平，從而上調JAM-A表達。激活的JAM-A通過Rap1a/β1整合素信號通路增強T細胞黏附能力，而miR-26a-5p與EZH2形成負反饋調控環(huán)路。靶向抑制EZH2可有效緩解小鼠狼瘡模型病情，為SLE治療提供了新的潛在靶點和理論依據(jù)。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡，一種累及全身多器官的自身免疫性疾病，就像一個免疫系統(tǒng)“認友為敵”的混亂戰(zhàn)場。其中，活化的炎癥性T細胞浸潤器官是導致組織損傷的關鍵步驟，而這個“入侵”過程離不開細胞黏附與遷移分子的幫助。連接黏附分子A，這個通常在上皮細胞緊密連接處維持“邊防”的蛋白，被發(fā)現(xiàn)可能在T細胞的“越境”行為中扮演著重要角色。同時，科學家們注意到，在SLE患者的T細胞中，存在著廣泛的表觀遺傳調控異常，比如組蛋白修飾和DNA甲基化的改變，這被認為是驅動疾病發(fā)生發(fā)展的“幕后黑手”。那么，這兩者之間是否存在聯(lián)系？一種名為EZH2的組蛋白甲基轉移酶，其異常表達已被發(fā)現(xiàn)在多種疾病中起作用，它是否會與JAM-A“聯(lián)手”，共同導演SLE中T細胞的異常黏附與遷移這場“戲”呢？為了揭開這個謎團，由云南大學崔清華、丁磊等人領導的研究團隊開展了深入探索，相關成果發(fā)表在《Journal of Translational Autoimmunity》上。
為了回答上述問題，研究人員運用了多種關鍵技術。他們首先采集了SLE患者和健康志愿者的外周血，分離外周血單個核細胞和T細胞進行后續(xù)分析。在細胞模型上，他們使用了EZH2的特異性抑制劑GSK126或小干擾RNA來敲低EZH2或JAM-A的表達，也通過質粒轉染過表達JAM-A。通過染色質免疫共沉淀技術分析了H3K27me3和DNMT3A在靶基因啟動子區(qū)的結合情況，并通過亞硫酸氫鹽測序PCR檢測了JAM-A啟動子區(qū)的DNA甲基化水平。細胞黏附能力則通過Boyden小室體外黏附實驗進行評估。此外，研究還利用雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-26a-5p與EZH2、Rap1a的靶向關系，并在MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠模型上進行了in vivo藥效評價。
3.1. JAM-A和EZH2在SLE患者PBMCs和T細胞中的表達增加
研究人員發(fā)現(xiàn)，與健康供者相比，SLE患者外周血單個核細胞和T細胞中JAM-A和EZH2的mRNA和蛋白表達水平均顯著上調，且兩者表達呈正相關。未接受治療的新發(fā)SLE患者（高JAM-A染色組）中JAM-A陽性細胞比例更高，而經(jīng)臨床治療后（低JAM-A染色組）該比例下降，提示JAM-A和EZH2是與SLE疾病活動性相關的激活因子。
3.2. JAM-A受EZH2修飾的DNMT3A甲基化調控
有意思的是，通常作為轉錄抑制因子的EZH2，其表達卻與JAM-A正相關。機制研究表明，在T細胞或Jurkat細胞中使用GSK126抑制劑或EZH2 siRNA敲低EZH2后，H3K27me3水平下降，而DNA甲基轉移酶DNMT3A（而非DNMT1或DNMT3B）的表達反而上調。這導致JAM-A基因啟動子區(qū)域（-275至+247 bp）的甲基化水平升高，從而抑制了JAM-A的表達。染色質免疫共沉淀實驗證實，抑制EZH2后，H3K27me3在DNMT3A啟動子近端區(qū)域的占據(jù)減少，而DNMT3A在JAM-A轉錄起始區(qū)域上游的結合增強。在SLE患者T細胞中，DNMT3A的mRNA表達與EZH2、JAM-A的mRNA表達均呈顯著負相關。這些結果揭示了EZH2通過H3K27me3抑制DNMT3A，進而由DNMT3A去甲基化激活JAM-A表達的級聯(lián)調控機制。
3.3. 抑制EZH2和JAM-A可抑制β1整合素依賴的T細胞對細胞外基質的黏附
SLE的特征之一是T細胞過度活化的黏附和遷移。體外黏附實驗表明，SLE患者T細胞的黏附能力高于健康對照。用GSK126或EZH2 siRNA處理T細胞或Jurkat細胞，其黏附能力顯著降低。使用中和抗體J10.4阻斷JAM-A的同源二聚化，同樣能減少細胞對基質包被濾膜的黏附。機制上，在Jurkat細胞中過表達JAM-A可上調Rap1a和β1整合素的表達并增強細胞黏附；反之，敲低JAM-A則產(chǎn)生相反效果。這證明JAM-A通過調節(jié)Rap1a/β1整合素信號通路來調控T細胞的黏附能力。
3.4. EZH2與miR-26a-5p之間的負反饋環(huán)路
研究進一步發(fā)現(xiàn)了微觀層面的精細調控。通過生物信息學預測和驗證，他們確定miR-26a-5p可以直接靶向EZH2。在T細胞和Jurkat細胞中轉染miR-26a-5p模擬物，可下調EZH2和H3K27me3的表達。反過來，抑制EZH2的表達（用GSK126或siRNA）則會上調miR-26a-5p的水平。染色質免疫共沉淀實驗顯示，抑制EZH2后，H3K27me3在miR-26a-5p宿主基因CTDSPL和CTDSP2啟動子區(qū)域的富集減少。這表明miR-26a-5p直接靶向EZH2，而miR-26a-5p自身又受到EZH2介導的H3K27組蛋白三甲基化的表觀遺傳抑制，從而形成了一個負反饋調節(jié)環(huán)路。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p也能靶向Rap1a，從而在多個層面參與調控。
3.5. 用GSK126抑制EZH2可改善MRL/lpr小鼠的狼瘡樣疾病表型
為了驗證靶向EZH2的治療潛力，研究在MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠模型中使用了EZH2高選擇性抑制劑GSK126。結果顯示，GSK126治療能顯著提高小鼠存活率，降低血漿中抗雙鏈DNA抗體滴度，減少脾臟中白細胞介素-10和轉化生長因子-β的表達，并減輕腎臟腎小球的病理損傷。免疫組化顯示，小鼠腎臟中JAM-A和β1整合素的表達也明顯降低。蛋白印跡分析證實，GSK126治療降低了脾細胞中EZH2、H3K27me3、JAM-A、Rap1a和β1整合素的表達，同時升高了DNMT3A的表達。這些體內實驗結果表明，抑制EZH2能夠有效緩解狼瘡樣疾病的進展。
綜合以上研究結果，本文得出結論：在SLE患者T細胞中，EZH2表達上調，通過催化產(chǎn)生H3K27me3抑制了DNMT3A的表達，進而導致JAM-A啟動子區(qū)低甲基化和其表達升高。高表達的JAM-A通過激活Rap1a/β1整合素信號通路，增強了T細胞的黏附能力。與此同時，EZH2與miR-26a-5p之間形成了一個負反饋調控環(huán)路，并且miR-26a-5p也靶向抑制Rap1a，構成了一個復雜的調控網(wǎng)絡。最終，這共同導致了T細胞過度黏附和遷移，參與SLE的發(fā)病過程。
這項研究的意義重大。首先，它首次系統(tǒng)地闡明了EZH2通過表觀遺傳級聯(lián)（EZH2/H3K27me3 → DNMT3A → JAM-A）調控T細胞黏附分子表達的新機制，為理解SLE的免疫病理機制提供了新的視角。其次，研究揭示了EZH2、miR-26a-5p、JAM-A和Rap1a之間構成的復雜調控網(wǎng)絡，展現(xiàn)了疾病中多層面調控的交互作用。最重要的是，研究通過體內外實驗證明，靶向抑制EZH2（使用GSK126）能夠有效逆轉上述異常調控，并緩解狼瘡模型小鼠的疾病癥狀，這為SLE的治療提供了一個極具潛力的新靶點。JAM-A和EZH2有可能成為SLE疾病活動性的診斷生物標志物，而針對EZH2-JAM-A軸的干預策略，例如使用EZH2抑制劑，有望發(fā)展為未來SLE治療的新方法。
