《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Imidazole Propionate Induces Kidney Damage by Activating the ROS-NLRP3 Signaling Pathway Through mTOR Inhibition of Autophagy in Renal Tubular Epithelial Cells
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本文揭示了腸道菌群代謝產物咪唑丙酸（ImP）誘導小鼠腎臟損傷的新機制。研究發現，ImP通過特異性激活mTOR信號通路抑制腎小管上皮細胞的自噬，進而誘導活性氧簇（ROS）產生，并激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體，最終導致促炎細胞因子白介素-1β（IL-1β）的表達，造成腎臟結構與功能異常。值得注意的是，mTOR抑制劑雷帕霉素（Rap）能夠恢復自噬、抑制ROS/NLRP3/IL-1β軸，從而減輕ImP誘導的腎損傷。該研究不僅闡明了ImP的潛在腎毒性，也為靶向腸道菌群代謝物進行腎臟疾病的預防與治療提供了理論基礎。
2.1. 咪唑丙酸對正常小鼠腎功能的影響
為探究咪唑丙酸（ImP）對正常小鼠腎功能的影響，研究將C57BL/6小鼠隨機分為三組：ImP處理組、ImP聯合雷帕霉素（Rap）干預組和生理鹽水對照組（NC）。實驗結果顯示，與NC組相比，ImP組小鼠體重顯著增加，而聯合Rap干預后體重顯著下降。各組間空腹血糖水平無顯著差異。進一步的腎功能評估顯示，ImP組小鼠的尿白蛋白/肌酐比值（ACR）水平顯著升高，而Rap干預可有效逆轉此趨勢。組織病理學分析發現，ImP組小鼠出現腎小球基底膜增厚、系膜基質增生伴細胞增殖，以及腎小管肥大和增生等病理改變。這些變化共同損害了腎小球的濾過屏障功能并減少了白蛋白的重吸收，從而導致ACR水平升高。Rap干預顯著改善了ImP誘導的腎臟病理損傷并降低了ACR水平。為闡明ImP誘導的腎臟炎癥反應，研究者通過免疫組化檢測了腎組織中白介素-1β（IL-1β）的表達水平。結果顯示，ImP組腎小管中IL-1β的表達顯著上調，而Rap干預可有效抑制其表達。此外，血清IL-1β水平的變化趨勢與組織表達結果一致。以上結果表明，ImP可引起正常小鼠腎功能損傷并誘導腎小管炎癥反應，而Rap可有效緩解這一病理過程。
2.2. 咪唑丙酸和雷帕霉素對體內外腎細胞自噬水平的影響
本研究基于前期研究，用三種濃度的ImP處理人腎小管上皮細胞（HK-2），以探究其對腎細胞增殖的影響。結果顯示，ImP在24小時和48小時處理后以濃度依賴性方式顯著抑制HK-2細胞增殖。同時，細胞周期調控蛋白——細胞周期蛋白D1（CYCLIN D1）和細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的表達水平隨著ImP濃度的增加而逐漸下調。動物實驗也證實，ImP顯著降低了腎組織中CYCLIN D1和CDK2的表達，而Rap干預則有效逆轉了這些蛋白的下調。鑒于mTOR和AMPK通路在維持腎細胞生長、分化、結構完整性和正常腎功能方面的關鍵作用，研究者首先檢測了小鼠腎組織中mTOR信號通路關鍵分子的表達水平。蛋白質印跡結果顯示，與NC組相比，ImP組中磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白的表達顯著上調，而磷酸化AMPK（p-AMPK）/AMPK和磷酸化AKT（p-AKT）/AKT的表達水平無顯著差異。為驗證此結果，在HK-2細胞模型中進行了平行實驗。結果顯示，ImP干預能夠以劑量依賴性方式激活mTOR信號通路，而Rap干預可顯著逆轉此效應。與動物實驗一致，干預后p-AMPK/AMPK和p-AKT/AKT的蛋白表達仍無差異。這些結果表明ImP能夠特異性激活mTOR信號通路。
2.3. 咪唑丙酸和雷帕霉素對體內外腎細胞自噬水平的影響
鑒于mTOR在自噬調節中的核心作用，研究者進一步探究了自噬是否參與了ImP介導的腎損傷。微管相關蛋白1輕鏈3/微管相關蛋白2輕鏈3（LC3Ⅱ/LC3I）是自噬體的標志物，其表達水平與自噬活性正相關。動物實驗結果顯示，與NC組相比，ImP組小鼠腎組織中LC3Ⅱ/LC3I蛋白表達顯著降低，而p62蛋白水平顯著升高。Rap干預顯著恢復了LC3Ⅱ/LC3I的表達并降低了p62水平。體外實驗顯示，ImP以劑量依賴性方式抑制HK-2細胞的自噬活性，此效應可被Rap處理逆轉。為驗證自噬流的變化，研究者采用了mRFP-GFP-LC3雙熒光標記系統，結果表明ImP以劑量依賴性方式顯著抑制自噬流，而Rap可恢復自噬。這些發現共同表明，ImP通過激活mTOR信號通路抑制腎細胞自噬。
2.4. 咪唑丙酸和雷帕霉素對體內外腎細胞ROS-NLRP3信號通路的影響
自噬與ROS-NLRP3信號通路之間存在復雜的調控相互作用。為闡明其機制，研究者通過免疫組化評估了小鼠腎臟中NLRP3的表達，使用DCFH-DA熒光探針測量了細胞內ROS水平，并通過蛋白質印跡分析了NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β的蛋白表達。結果表明，與NC組相比，ImP組腎小管中NLRP3表達顯著升高，腎組織中NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β蛋白水平顯著上調。Rap干預顯著降低了NLRP3表達，抑制了ROS的產生，并抑制了裂解的Caspase-1和IL-1β的過表達。在細胞實驗中，ImP處理顯著增加了HK-2細胞內的ROS水平，并以劑量依賴性方式誘導NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β蛋白表達上調。Rap預處理顯著減弱了ROS的產生，并抑制了NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β蛋白的過度表達。這些數據共同表明，ImP通過激活ROS-NLRP3信號通路誘導腎臟炎癥反應，而Rap干預有效緩解了這一過程。
2.5. mRNA測序與分析
隨后，研究者收集了小鼠腎組織進行RNA測序。主成分分析圖顯示三組之間區分明顯。火山圖顯示，持續攝入ImP 3個月導致152個基因上調和24個基因下調。Rap處理導致29個基因上調和264個基因下調。在NC、ImP和ImP+Rap組中總共鑒定出87個重疊基因。為探索這些差異表達基因的功能分類，進行了功能富集分析。在NC和ImP腎臟中，ImP組富集的通路主要與“信號受體活性”和“分子轉導活性”相關，而NC組則在“細胞外基質結構成分”和“細胞骨架蛋白結合”方面富集。與ImP組相比，ImP+Rap組在“線粒體蛋白復合物”、“脂肪酸分解代謝過程”和“線粒體翻譯”方面富集。京都基因與基因組百科全書通路分析顯示，“代謝通路”和“MAPK信號”在NC和ImP腎臟中富集，而ImP+Rap組則在“線粒體自噬”和“近端小管碳酸氫鹽重吸收”等通路中富集。
3. 討論
咪唑化合物在食物中具有顯著的生物蓄積性，可能通過攝入后與腸道菌群相互作用介導不良健康結局。本研究的實驗發現通過體內外模型證實，ImP暴露主要導致腎小管區室中IL-1β和NLRP3表達的顯著上調。ImP處理后，HK-2細胞的增殖和自噬均受到劑量依賴性抑制，同時磷酸化mTOR和p62蛋白水平顯著升高，而對p-AMPK/AMPK或p-AKT/AKT表達未檢測到實質性影響。值得注意的是，Rap預處理有效逆轉了ImP誘導的mTOR過度激活，恢復了p62的積累，并挽救了LC3-II的表達缺陷。這些發現共同表明，ImP通過mTOR介導的腎小管自噬抑制發揮其腎毒性作用。這一機制見解將mTOR通路調控定位為抵消ImP誘導腎損傷的潛在治療靶點。
4. 材料與方法
本研究使用的化學物質包括ImP和Rap。使用的抗體包括CDK2單克隆抗體、細胞周期蛋白D1單克隆抗體、兔抗人mTOR單克隆抗體、兔抗人p-mTOR單克隆抗體、兔抗人LC3B單克隆抗體、小鼠抗人p62單克隆抗體、兔抗人NLRP3單克隆抗體、兔抗人Caspase-1多克隆抗體和小鼠抗人IL-1β單克隆抗體。其他試劑包括人IL-1β ELISA試劑盒、ROS檢測試劑盒、自噬雙標記腺病毒。
HK-2細胞系培養于補充了10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基中，置于37°C、5% CO2的濕潤環境中。
使用雄性C57BL/6J小鼠，隨機分為三組：正常組、ImP組和ImP+Rap組。從7周齡開始，每日腹腔注射給藥：正常組接受150 μL生理鹽水；ImP組接受100 μg ImP；ImP+Rap組同時給予100 μg ImP和3 mg/kg Rap。連續干預12周后，收集尿液樣本，之后對小鼠實施安樂死，采集血清和腎組織并儲存于-80°C用于后續分析。
