《Environmental DNA》：Genomics-Based Approaches to Ant Monitoring in Land Management: Validation of COI Metabarcoding Primers
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本綜述系統驗證了用于螞蟻（蟻科）生物監測的COI元條形碼（DNA metabarcoding）特異性引物。研究通過（in silico）、體外（in vitro）和原位（in situ）分層評估框架，首次確認了螞蟻特異性引物AntF1/AntR1在澳大利亞熱帶稀樹草原環境中，能有效從土壤環境DNA（eDNA）和標本中檢測螞蟻多樣性，克服了傳統形態學鑒定的局限性，為土地利用管理中的螞蟻生物監測提供了基因組合學解決方案。
1 引言
生物多樣性評估是監測生態系統健康、指導土地管理的基本工具。螞蟻（膜翅目：蟻科）作為在全球占主導地位的無脊椎動物，是生態系統變化的常用生物指示劑。它們通過參與營養循環、土壤更替、種子傳播、植物防御和動物食物網，在生態系統中扮演著關鍵角色。然而，傳統的螞蟻監測依賴于形態學鑒定，這種方法耗時、容易出錯，且日益受到分類學專業知識匱乏的限制。基因組學方法，特別是DNA元條形碼技術，有潛力從根本上改變無脊椎動物生物多樣性調查的方式。該技術通過對從混合樣本（如大量標本或環境樣本）中提取的DNA進行短基因區域（如COI、16S）的PCR擴增、高通量測序，并結合參考數據庫進行物種分類學鑒定，能夠以比形態學方法少得多的時間和精力，同時鑒定多種生物。
但通過元條形碼檢測到的類群比例受多種因素影響，包括所選標記基因的分類學分辨率、引物的特異性以及引物數量。線粒體COI區域是元條形碼研究陸生無脊椎動物最常用的標記，其高變異性有助于在物種水平上進行區分。然而，這種高變異性也使設計真正通用的引物組變得困難，因此需要經過良好驗證的引物來克服這一問題。引物結合位點應盡可能與目標物種的模板序列匹配，尤其是在3‘末端，以盡量減少擴增和檢測的偏倚。
螞蟻特異性的元條形碼監測方法在eDNA樣本中的應用尚未得到驗證。盡管已有研究開發了針對螞蟻的短擴增子COI元條形碼引物，但其較短的擴增子長度限制了分類學分辨率。因此，目前仍缺乏經過環境樣本評估驗證的螞蟻特異性元條形碼引物組。本研究旨在填補這一空白，通過開發和測試螞蟻特異性COI引物組，并與通用陸生無脊椎動物引物進行比較，評估它們在eDNA樣本中檢測螞蟻物種的性能，以期提供一種經過驗證的元條形碼方法來支持螞蟻生物監測在土地管理中的廣泛應用。
2 材料與方法
本研究遵循推薦的驗證指南，采用分層工作流程來選擇檢測螞蟻類群性能最佳的引物，涵蓋（in silico）、體外（in vitro）和原位（in situ）分析。
2.1 概述
在（in silico）分析階段，我們評估了14個COI引物組，包括三個新設計的螞蟻特異性引物（AntF1、AntR1和EPTDr2n_Ant）和17個之前已驗證用于陸生節肢動物的通用無脊椎動物引物。在體外（in vitro）階段，對三個性能最佳的引物組（AntF1/AntR1、fwhF2/EPTDr2n_Ant和fwhF2/fwhR2n）進行了梯度PCR優化，并使用等摩爾DNA輸入的模擬群落評估了擴增偏倚。為了模擬環境檢測，還將已知拷貝數的合成gBlock和模擬群落樣本“摻入”（spike-in）到混合環境樣本中。最后，選取兩個性能最佳的引物組進行原位（in situ）案例研究，使用從北領地野生動物公園（先前曾進行過螞蟻調查）采集的土壤樣本中提取的eDNA進行分析。
2.2 （in silico）分析
2.2.1 參考數據庫構建
從博物館的館藏標本中獲取了涵蓋19個澳大利亞螞蟻屬的COI條形碼，并利用CRABS工具補充了公共條形碼庫（BOLD）的數據。構建了用于模擬群落和案例研究的單獨參考數據庫，并生成了一個包含蟻科所有已知屬的廣泛參考集以評估引物的全局擴增成功率。
2.2.2 引物設計與評估
序列經聚類、比對后，使用PrimerMiner工具評估已發表引物，以確定具有良好分類覆蓋度的引物。通過比對結果可視化檢查跨類群的保守區域，據此設計新的引物，以最大限度地減少錯配并提高對目標類群的分辨率。AntF1和AntR1通過修改現有引物（AncientLepF3和fwhF2）得到，EPTDr2n_Ant則從水生大型無脊椎動物反向引物EPTDr2n改進而來。所有引物（包括新設計）均使用PrimerMiner評估其與模板的錯配罰分。最終，基于對全局可用蟻科條形碼的（in silico）PCR篩選，評估了三個最佳引物對（AntF1/AntR1、fwhF2/EPTDr2n_Ant和fwhF2/fwhR2n）的擴增成功率。
2.3 體外（in vitro）分析
2.3.1 梯度PCR與模擬群落性能
梯度PCR確定了AntF1/AntR1、fwhF2/EPTDr2n_Ant和fwhF2/fwhR2n的最佳退火溫度為50°C。使用包含37個澳大利亞螞蟻屬（代表7個亞科）的等摩爾模擬群落評估了引物的擴增偏倚和分類學分辨率。AntF1/AntR1和fwhF2/fwhR2n分別恢復了37個屬中的25個（68%）和26個（70%），而fwhF2/EPTDr2n_Ant僅恢復了2個屬（0.05%）。各屬的測序讀長比例偏離了等摩爾預期，顯示出特定類群的擴增偏倚。在分類學鑒定方面，fwhF2/fwhR2n在物種水平上表現出更好的鑒定能力。
2.3.2 土壤摻入實驗中的錯配與環境抑制效應
將具有零錯配和3-4個錯配的合成gBlock以不同拷貝數摻入混合土壤樣本中，以評估引物-模板錯配和土壤環境基質對檢測的影響。結果發現，即使使用零錯配模板，當拷貝數低于約2×103時也難以被檢出；而帶有3個或更多錯配的模板，則需要極高豐度（>1.58×105拷貝）才能在土壤基質中被檢測到。這凸顯了錯配（尤其位于3‘末端時）和環境抑制物對擴增效率的強烈抑制作用。將模擬群落摻入土壤后，所有引物的屬水平檢出率均下降，表明環境基質存在抑制效應。其中，AntF1/AntR1對土壤環境基質抑制的耐受性優于fwhF2/fwhR2n，而fwhF2/EPTDr2n_Ant表現不佳，不適合進一步的原位測試。
2.4 原位（in situ）eDNA案例研究
從北領地野生動物公園的長期火干擾實驗地采集了五個表層土壤樣本，并使用AntF1/AntR1和fwhF2/fwhR2n引物對進行eDNA元條形碼分析。與之前通過大量陷阱調查在同一地塊記錄的28個屬相比，土壤eDNA檢測到15個屬。螞蟻特異性引物對AntF1/AntR1檢測到14個屬，而fwhF2/fwhR2n檢測到7個屬。兩種方法共享6個屬。eDNA還檢測到三個在特定樣地陷阱調查中未記錄的屬（Anochetus、Ochetellus和Stigmacros），盡管它們在該研究地點的其他區域已知。這很可能反映了螞蟻在樣地內分布的空間異質性，而非方法性能差異。值得注意的是，eDNA和陷阱捕捉捕獲的是不同的生態信息：eDNA指示了采樣土壤體積內生物（只要DNA持續存在，無論死活）的存在，而陷阱則測量地表活躍個體的活動密度。
3 結論
螞蟻是土地管理中廣泛使用的生物指示劑，本研究首次提供了專門針對螞蟻的元條形碼引物的靶向驗證，為螞蟻監測的基因組學方法奠定了堅實基礎。通過（in silico）、（in vitro）和（in situ）的分層性能評估，研究證實了靶向性引物設計可提高蟻科物種的檢測效果。基于綜合性能，我們推薦AntF1/AntR1作為在澳大利亞（并可能在全球其他地區）進行螞蟻生物監測的主要檢測方案，適用于土壤eDNA調查和標本元條形碼分析；推薦fwhF2/fwhR2n作為標本元條形碼分析的備選方案。本研究為將eDNA方法納入土地管理的螞蟻生物監測提供了一個經過驗證的工具，有助于實現規模化、高通量的螞蟻群落監測，同時與專家分類學知識形成互補。未來的研究應進一步優化螞蟻特異性引物，以最大限度地減少結合位點錯配和抑制效應，并在評估不同陸地生態系統中螞蟻群落組合變化的大規模研究中評估這些檢測方案的重復性。
