引言

希瓦氏菌（Shewanella）是一類代謝能力極為廣泛的兼性厭氧細菌，能夠定植于多種水生環境，包括受化學污染的生境，這使得該屬成為環境污染物修復的有力工具。其能量代謝，特別是對多種無機和有機化合物的轉化能力，一直是研究熱點。某些希瓦氏菌種已被證明能夠利用硫代硫酸鹽脫氫酶（Tsd）氧化硫代硫酸鹽（S₂O₃^2?），利用亞硫酸鹽脫氫酶（SDH）氧化亞硫酸鹽（SO₃^2?）。另一些則被證實可以利用同源多硫化物還原酶（Psr）的酶厭氧呼吸多硫化物（S_n^2?）、元素硫（S⁰）和S₂O₃^2?，利用細胞色素亞硫酸鹽還原酶（SirA）呼吸SO₃^2?，以及利用鉬酶Dms呼吸二甲亞砜（DMSO）。值得注意的是，水生細菌S. oneidensisMR-1已被證明可以呼吸四硫酸鹽（S₄O₆^2?），而這一能力長期以來被認為是人類腸道病原體（如腸桿菌科細菌）的特權，因為S₄O₆^2?被認為是腸道炎癥的產物，其呼吸能力可為病原體提供競爭優勢。然而，環境細菌還原S₄O₆^2?的能力已被報道數十年。盡管在腸道病原體鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica）中負責S₄O₆^2?還原的酶——四硫酸鹽還原酶（Ttr）已被鑒定和表征，但該酶在包括希瓦氏菌在內的環境細菌中的功能作用仍有待確立。

來自S. oneidensisMR-1的可溶性八血紅素四硫酸鹽還原酶（OTR）已被證明能在體外還原S₄O₆^2?，并被提議為體內S₄O₆^2?還原的負責酶，但其生理功能從未被確立。已知最著名的能夠厭氧還原S₄O₆^2?為S₂O₃^2?的酶系統是膜結合、醌反應的鉬酶TtrABC。由于ttr基因的同源物已在腸桿菌科以外的門中被鑒定，基于Ttr的S₄O₆^2?呼吸也可能存在于其他門中，包括希瓦氏菌。除Ttr外，Tsd細胞色素也是希瓦氏菌中S₄O₆^2?還原的一個有希望的候選者。Tsd在S. oneidensis的有氧S₂O₃^2?氧化中已被充分表征，但也被證明是Wolinella succinogenes和Campylobacter jejuni中厭氧還原S₄O₆^2?的原因。

本研究旨在分子水平上解析希瓦氏菌中S₄O₆^2?的還原過程，以希瓦氏菌sp. ANA-3（后文簡稱ANA-3）為模型。該菌株已被證明能夠還原多種化合物，包括砷酸鹽、銻酸鹽、碘酸鹽和鐵，但其還原硫化合物的能力從未被檢驗。本研究通過對基因組進行詳細分析，識別所有可能直接或間接參與S₄O₆^2?代謝的酶，并分析使用自殺克隆載體pKNG101進行框內基因缺失誘變獲得的缺失突變體的表型。我們刪除了每個可能參與S₄O₆^2?代謝的基因簇或它們的組合，并分析了它們與S₂O₃^2?和S₄O₆^2?相關的呼吸能力。我們還檢查了推定的S₄O₆^2?呼吸酶的體外酶活性。最后，我們基于序列分析討論了廣泛存在的Ttr樣酶的功能。

基因組分析揭示ANA-3中多種潛在的四硫酸鹽還原酶

為了闡明ANA-3中S₄O₆^2?和S₂O₃^2?的代謝，首先需要確定該細菌基因組中編碼可能參與轉化這些化合物及其產物的酶的基因內容。通過BLAST分析，鑒定出一個多硫化物還原酶Psr同源物、一個四硫酸鹽還原酶Ttr同源物以及八血紅素四硫酸鹽還原酶OTR。同時還鑒定出一個TsdBA系統，該系統可能負責S₄O₆^2?的還原和S₂O₃^2?的氧化。由于SO₃^2?是Ttr、OTR和Psr聯合功能的標記物，我們尋找了除了Sir之外可能消耗或產生SO₃^2?從而干擾其隨時間演變的酶。研究還揭示了硫酸鹽（SO₄^2?）胞質同化還原途徑的一部分，包括ATP硫酸化酶CysN、APS激酶CysC和PAPS還原酶CysH，它們允許從SO₄^2?產生SO₃^2?。

被鑒定的Ttr同源物參與四硫酸鹽代謝

三聯體SHEWANA3_RS03345-SHEWANA3_RS03350-SHEWANA3_RS03355被鑒定為潛在的ttrBCA基因簇。在最小培養基中測試K₂S₄O₆作為厭氧呼吸底物。即使在厭氧條件下，S₄O₆^2?也會隨時間發生非生物轉化，轉化為S₃O₆^2?和S₂O₃^2?。野生型ANA-3菌株呼吸S₄O₆^2?導致其在9小時內被完全還原。此呼吸的連續還原產物是S₃O₆^2?、S₂O₃^2?、SO₃^2?。S₃O₆^2?濃度隨時間的變化是雙相的。初始階段（0-6小時）對應于從5 mM S₄O₆^2?瞬時積累0.8 mM S₃O₆^2?，而第二階段（6-9小時）對應于S₃O₆^2?的主要生物呼吸與S₄O₆^2?的直接呼吸并行，產生了S₂O₃^2?。有趣的是，S₃O₆^2?的初始產生階段在野生型ANA-3菌株中比在化學對照中更快。這可以用SO₃^2?的生物生產來解釋，因為已知SO₃^2?會與S₄O₆^2?反應產生S₃O₆^2?。在S₄O₆^2?代謝的最后階段（9-58小時），積累的S₂O₃^2?被消耗以產生SO₃^2?和黑色沉淀物。從S₂O₃^2?生成SO₃^2?和HS^?表明Psr參與了S₂O₃^2?代謝。

為驗證鑒定的ttrBCA同源基因在S₄O₆^{2?呼吸中的作用，使用自殺克隆載體pKNG101刪除了ANA-3中的ttrBCA同源基因。所得缺失突變體（ANA-3 Δttr）對S₄O₆2?的還原顯著慢于野生型，但并未完全消除。S₃O₆2?的產生和還原以及S₂O₃2?產生的動力學也顯著減慢，而S₂O₃2?的還原未受影響。這些結果表明Ttr同源物在S₄O₆2?和S₃O₆2?的還原中起關鍵作用，正如先前在鼠傷寒沙門氏菌中對Ttr的演示。Δttr突變體中SO₃2?產生的延遲與缺失典型Ttr酶完全一致，該酶將S₃O₆2?轉化為S₂O₃2?和SO₃2?。然而，這些結果意味著Ttr同源物并非ANA-3中還原S₄O₆2?的唯一酶。此外，它們表明該酶不參與S₂O₃2?的還原。}

為識別參與S₄O₆^2?呼吸的其他系統，使用自殺克隆載體pKNG101刪除了ANA-3中的psrABC同源基因。所得Δpsr突變體對S₄O₆^2?、S₃O₆^2?和S₂O₃^2?的命運幾乎與野生型相同。然而，該突變體完全喪失了S₂O₃^2?的消耗和SO₃^2?的產生。這些結果表明psr同源基因是ANA-3中唯一參與S₂O₃^2?呼吸的基因，并且它們不參與S₄O₆^2?的還原。

被鑒定的Ttr同源物與鼠傷寒沙門氏菌Ttr酶聚類

觀察到S₄O₆^2?的還原僅部分基于ANA-3基因組中鑒定的ttr同源基因，這促使我們進一步分析鑒定的序列。典型的Ttr（以鼠傷寒沙門氏菌中表征的為例）是一種三聚體酶，是DMSO還原酶家族的成員。Ttr通過一個不含任何輔因子的亞基TtrC錨定在細胞質膜上。催化亞基TtrA攜帶一個鉬輔因子和一個鐵硫（Fe-S）簇，而電子轉移亞基TtrB攜帶四個Fe-S簇。盡管三個Ttr亞基與其他鉬酶中的對應物同源，但它們在ttr基因簇（ttrBCA）中顯示出特定的基因組織和一級序列差異，從而實現特異性識別。ANA-3中鑒定的Ttr序列滿足所有這些標準。然而，文獻報道了此類Ttr同源物實際上是As(V)還原酶，在系統發育上與真正的Ttr和真正的Arr都不同。此外，有Ttr同源物被提議在S₂O₃^2?歧化中起作用。我們重建了一個系統發育樹，其中包括來自呼吸S₄O₆^2?的鼠傷寒沙門氏菌、歧化S₂O₃^2?的Desulfolithobacter dissulfuricansGF1T、呼吸As(V)的Pyrococcus aerophilum和Anaeromyxobactersp. Strain PSR-1，以及ANA-3中鑒定的蛋白WP_011715816.1。重建的樹揭示了Ttr樣序列之間的巨大系統發育多樣性，暗示了不同的功能。Ttr樣As(V)還原酶形成兩個不同的系統發育分支。在細菌中鑒定出的、參與硫化合物歧化的序列似乎代表了多種情況，包括潛在的As^V還原酶、真正的S₄O₆^2?還原酶和兩個未知同源物的新分支。在Ttr子樹中，來自ANA-3的WP_011715816.1序列與真正的Ttr聚類。初步蛋白質組學分析結果也表明Ttr同源物在S₄O₆^2?條件下而非As^V或S₂O₃^2?條件下特異性過量產生。這些結果與誘變實驗確定的SHEWANA3_RS03355-SHEWANA3_RS03350-SHEWANA3_RS03345基因三聯體（編碼S₄O₆^2?還原酶活性）一致。

ΔttrΔpsr突變體無法呼吸四硫酸鹽

為了進一步研究除Ttr外可能參與S₄O₆^2?還原的其他酶，構建了ANA-3的幾個雙缺失突變體菌株，包括ΔttrΔtsdA、ΔttrΔotr和ΔttrΔpsr。Tsd已被確定為S. oneidensisMR-1中氧氣存在下的S₂O₃^2?氧化酶，但也被提議為限氧條件下S₄O₆^2?還原酶。在ANA-3 Δ