《Journal of Neuroendocrinology》：Biomarker-directed aptamer panels for diagnosis and differentiation of neuroendocrine tumors
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本文推薦了一項利用APTASHAPE平臺篩選核酸適配體（aptamer）組合用于神經內分泌腫瘤（NET）診斷與分型的研究。研究發現，所選的適配體組合能有效區分健康個體與NET患者（AUC最高達0.87），并能鑒別小腸NET（siNET）與胰腺NET（pNET）（AUC 0.72）。此外，質譜分析還鑒定出ITIH2和IGHG3作為NET診斷的潛在新型生物標志物。該研究為開發非侵入性、多標志物的NET液體活檢工具提供了新策略。
引言：神經內分泌腫瘤的診斷挑戰
神經內分泌腫瘤（Neuroendocrine tumors, NETs）是一組起源于神經內分泌細胞的異質性腫瘤，最常發生于胃腸道和肺部。在胃腸道中，原發性NETs最常見于小腸（siNET）和胰腺（pNET）。這些腫瘤具有高度異質性的臨床特征，從惰性生長到侵襲性轉移性疾病均有發生，導致臨床預后差異極大。目前，用于NET診斷、疾病進展評估和治療效果監測最常研究的非侵入性生物標志物是嗜鉻粒蛋白A（Chromogranin A, CgA）和5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）。然而，越來越多的證據表明這些標志物作為NET生物標志物存在局限性，例如CgA在siNET和pNET的診斷和監測中敏感性不足，而相當一部分腸胰NET患者的5-HIAA水平低于正常上限，且與疾病進展的關聯性較弱。因此，亟需新型、準確、非侵入性的標志物來指導臨床醫生診斷和監測NET患者。多標志物聯合檢測被視為改善臨床決策的潛在策略，而血漿蛋白質組學的表征具有強大的臨床應用潛力。
APTASHAPE技術簡介
本研究采用了一種名為APTASHAPE的新方法，用于在生物體液中評估和鑒定生物標志物。該技術從一個包含1015個修飾RNA寡核苷酸的隨機庫中篩選能與人類血漿蛋白質組中幾乎任何蛋白質表位特異性結合的結合子，即核酸適配體（aptamers）。其核心在于，通過差異篩選，識別出一組有限的、對疾病相關蛋白質具有特異性的適配體，其原理是適配體與血漿樣品中蛋白質結合的豐度差異反映了樣本間靶蛋白表達或修飾的變化。本研究假設APTASHAPE平臺可以篩選出用于NET無創診斷以及區分siNET與pNET的生物標志物導向型適配體組合。
研究方法與人群
研究共納入92份血漿樣本，其中68份來自NET患者（48例siNET，20例pNET），24份來自健康個體。所有樣本隨機平均分為開發集和測試集。開發集用于識別能夠區分（1）健康個體與NET患者，或（2）siNET與pNET患者的適配體，并在測試集中評估這些組合的性能。APTASHAPE分析使用一個已建立的、富集了可識別人血漿樣本中蛋白質的適配體庫�；谪S度排名，研究選取了前350個最豐富的適配體進行分析。通過普通最小二乘（OLS）回歸分析識別組間存在差異豐度的適配體，篩選標準是回歸系數變化≥0.25且本雅明尼-霍赫貝格校正p值≤0.05。適配體組合的性能通過計算受試者工作特征曲線下面積（AUC）值及其95%置信區間（CI）進行評估，并與CgA和游離DNA（cfDNA）進行比較。此外，通過質譜分析（MS）對部分適配體進行交叉比對，以鑒定其潛在的蛋白質靶點。
研究結果：適配體組合的篩選與效能
1. 區分健康個體與NET患者
從350個高豐度適配體中，APTASHAPE分析在開發集中識別出68個在NET患者與健康個體間存在差異豐度的適配體，其中19個在NET中豐度升高，49個豐度降低。由這些適配體構成的組合在開發集中區分健康個體與NET患者的AUC為0.74，在測試集（驗證集）中AUC提升至0.87，顯示出優異的診斷潛力。具體性能指標見表2。
2. 區分小腸神經內分泌腫瘤與胰腺神經內分泌腫瘤
同樣，從350個適配體中，分析識別出31個在siNET與pNET患者間存在差異豐度的適配體，構成了另一個適配體組合。其中，30個適配體在pNET中豐度更高，1個豐度更低。該組合在區分siNET與pNET的任務中，在開發集和測試集中均取得了0.72的AUC。相比之下，CgA在開發集和測試集中的AUC分別為0.66和0.79，而cfDNA在此區分任務中沒有表現出判別能力（AUC分別為0.46和0.44）。
3. 樣本量與效能分析
研究進行了事后效能分析。對于區分健康對照與NET患者，開發集和測試集的效應量（Cohen's d）分別為1.09和1.59，表明效應量大。所需樣本量在開發集中為每組14-15人，測試集中為每組7-8人，本研究樣本量已滿足。對于區分siNET與pNET，開發集效應量為1.02（大），測試集為0.74（中等至大）。開發集中siNET組樣本量（n=24）滿足效能要求，但測試集中兩組（siNET: n=24, pNET: n=9）均未達到最佳效能，特別是pNET組樣本量不足，表明需要更大規模的隊列來最終確立該組合在區分NET亞型方面的能力。
4. 潛在新型蛋白生物標志物的鑒定
通過交叉參考先前一項在代謝功能障礙相關脂肪性肝�。∕ASLD）研究中利用質譜鑒定出的適配體序列，本研究中用于區分健康個體與NET患者的適配體組合內有4個適配體被識別出具有已知的潛在蛋白質靶點。其中，三個適配體最可能結合間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H2（Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2, ITIH2），另一個適配體最可能結合免疫球蛋白重鏈恒定區γ3（Immunoglobulin heavy constant gamma 3, IGHG3）。這兩種蛋白被確定為NET診斷的潛在新型生物標志物。
討論：研究的臨床意義與未來展望
本研究首次探討了利用APTASHAPE技術篩選的適配體組合在NET診斷和siNET與pNET分型中的性能。主要發現是兩個獨立的適配體組合分別能準確區分健康個體與NET患者，以及區分siNET與pNET患者。這凸顯了適配體組合中所包含適配體的蛋白質靶點具有重要的生物學相關性。
當前NET的液體活檢臨床評估主要依賴CgA和5-HIAA等單一生物標志物測量，存在敏感性不足等問題。本研究采用的多標志物適配體組合方法有望克服單一標志物的局限性，同時保持與CgA和5-HIAA測量相當的診斷準確性，這與利用多組學技術診斷NET的既往嘗試方向一致。雖然CgA在本研究隊列中區分siNET與pNET的表現與適配體組合相當，但CgA通常被視為腫瘤負荷和疾病嚴重程度的標志物而非腫瘤定位指標，因此其作為區分亞型的單一標志物效用存疑。
通過質譜分析鑒定出的ITIH2和IGHG3是潛在的新型NET生物標志物。ITIH2在多種人類實體瘤中表達下調，而IGHG3在多種實體瘤中表達增加，但在NET中均未有過關聯報道，值得進一步探索。同時，本研究中其他被選中適配體的蛋白質靶點也有待鑒定。
本研究的優勢在于使用了特征明確的NET患者隊列以及APTASHAPE平臺。該平臺高通量、多重分析能力以及相對較低的成本，增加了發現與NET診斷或分期相關的新型血漿蛋白生物標志物的潛力。然而，研究也存在局限性，包括缺乏外部驗證、pNET患者樣本量相對較�。ㄩ_發集11例，測試集9例），以及健康對照年齡顯著年輕于NET患者，可能導致某些差異反映的是年齡相關的血漿蛋白組成變化而非NET特異性變化。此外，由于大多數樣本來自TNM IV期患者，無法評估該組合對早期NET的診斷性能，也因樣本量限制未能探究其區分轉移與非轉移疾病的能力。
結論
研究表明，APTASHAPE平臺是篩選用于NET診斷以及區分siNET和pNET的適配體組合的有效工具。此外，分析鑒定出ITIH2和IGHG3作為NET診斷的潛在新型生物標志物，值得在更大規模的NET患者隊列中進行進一步探索。這項研究為開發基于多標志物適配體組合的非侵入性NET診斷和分型工具奠定了重要基礎。
