《Plant Physiology and Biochemistry》：Melatonin activates plant defense against root-knot nematodes through the jasmonate pathway
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本研究探討了柳杉科植物中酚性松香烷型二萜類化合物（如鐵銹醇）的生物合成機制。針對其下游氧化步驟不清的問題，研究人員通過基因組挖掘、異源表達和系統發育分析，鑒定了臺灣杉中兩個新的CYP720B家族細胞色素P450酶（TcLO1和TcLO2），它們能夠催化左旋海松二烯氧化形成鐵銹醇。研究進一步揭示了CYP720B與二萜合酶（DTS）基因在柏亞綱植物基因組中普遍存在頭對頭緊密連鎖的保守結構，為理解針葉樹二萜生物合成與基因組進化提供了新見解。
在針葉樹的漫長演化史中，它們發展出了復雜而精妙的化學防御系統，其中一類名為酚性松香烷型二萜的化合物扮演著關鍵角色。這類化合物不僅賦予樹木心材卓越的耐腐性，如著名的臺灣杉（Taiwania cryptomerioides）就因其富含鐵銹醇（ferruginol）而聞名，而且其中一些衍生物（如臺灣杉醌類）還顯示出潛在的抗癌活性，具有重要的醫藥價值。然而，盡管這類化合物生態和藥理意義重大，其生物合成的完整路徑，特別是從共同前體左旋海松二烯（levopimaradiene）到鐵銹醇的關鍵氧化步驟，多年來一直是個未解之謎。同時，在松科植物中，負責二萜樹脂酸合成的細胞色素P450酶（CYP720B）已有較多研究，但在富含酚性松香烷的柏科及其近緣類群中，相應的氧化酶及其在基因組中的組織形式卻鮮為人知。為了填補這些知識空白，一項研究應運而生，旨在揭示臺灣杉中鐵銹醇合成的酶學機制，并探索相關基因在針葉樹基因組中的進化模式。這項研究最終發表在了《Plant Physiology and Biochemistry》期刊上。
為了回答上述問題，研究人員綜合運用了多種關鍵技術。首先，他們通過生物信息學方法，在柳杉（Cryptomeria japonica）基因組中挖掘與已知二萜合酶（DTS）基因相鄰的細胞色素P450候選基因。接著，從臺灣杉的轉錄組中克隆了同源基因（TcLO1和TcLO2）。隨后，利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大腸桿菌（Escherichia coli）異源表達系統，對候選P450酶的催化功能進行驗證，通過氣相色譜-質譜聯用（GC–MS）分析其代謝產物。此外，通過基因組PCR證實了臺灣杉中TcLO2與一個新鑒定的二萜合酶基因TcKSL9存在緊密的基因組連鎖。研究還進行了大規模的基因組調查，在多個柏亞綱和松科植物基因組中搜索CYP720B–DTS基因對。最后，通過最大似然法構建系統發育樹，并對基因對所在的基因組區域進行微共線性分析，以闡明其進化關系。
3.1. 候選CYP720B基因的鑒定與克隆
通過對柳杉基因組的分析，研究人員在染色體2和7上發現了兩個頭對頭緊密排列的CYP720B–DTS基因對，其間隔距離僅約2kb。從臺灣杉中克隆到了兩個同源基因TcLO1和TcLO2（后正式命名為CYP720B76和CYP720B22）。轉錄組數據顯示，這兩個基因在木材組織，尤其是心材過渡區高表達，這與鐵銹醇的積累部位相符。
3.2. TcLOs作為左旋海松二烯氧化酶的功能表征
在酵母和大腸桿菌中的異源表達實驗表明，表達TcLO1或TcLO2的工程菌株，其左旋海松二烯的積累量減少，并產生了兩個新產物。通過GC-MS譜圖比對，這兩個產物分別與松香三烯（abietatriene）和鐵銹醇的標準譜圖匹配。這表明TcLO1和TcLO2能夠催化左旋海松二烯發生氧化反應，生成松香三烯中間體，并進一步氧化形成鐵銹醇。
3.3. TcLO2在臺灣杉中與一個DTS形成保守的頭對頭基因對
基因組測序揭示，TcLO2與一個新發現的二萜合酶基因TcKSL9以頭對頭方向排列，間隔3,071 bp。功能實驗證實TcKSL9是一個左旋海松二烯合酶。因此，TcLO2和TcKSL9構成了一個物理上連鎖、功能上連續的生物合成基因對。
3.4. 柏科植物中的CYP720Bs形成一個與松科已知酶不同的進化枝
系統發育分析顯示，TcLO1和TcLO2與所有已功能表征的松科CYP720B酶明顯分開，形成了一個獨立的柏科-紅豆杉科進化枝，這表明柏科與松科的CYP720B酶在進化上遵循了不同的軌跡。
3.5. CYP720B–DTS基因對在針葉樹譜系中的分布
對多個針葉樹基因組的調查發現，頭對頭的CYP720B–DTS基因對廣泛存在于柏科、紅豆杉科、羅漢松科和南洋杉科（統稱柏亞綱）中。在部分松科植物（如火炬松）中也檢測到類似基因對，但在銀杏、蘇鐵、買麻藤綱以及被子植物（如水稻）中均未發現。
3.6. 柏亞綱植物中CYP720B–DTS基因對的進化關系
對基因對成分的系統發育和微共線性分析得出了重要結論：
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系統發育模式：大多數柏亞綱的成對DTS和CYP720B蛋白分別聚集在柏亞綱特異性的進化枝內，與松科的成對基因明顯分開。
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微共線性證據：在柏亞綱各物種（如臺灣杉、柳杉、杉木、竹柏）中，基因對兩側±5 Mb區域內存在大量同源基因的互惠最佳匹配（RBH）連接，表明局部基因組環境是保守的。然而，在分析的松科植物（如油松）與柏亞綱物種之間，則未檢測到這種局部微共線性。
綜合以上結果，本研究得出了明確的結論并進行了深入討論。首先，研究成功鑒定了臺灣杉中兩個新的CYP720B家族P450酶（TcLO1和TcLO2），它們能夠催化從左旋海松二烯到鐵銹醇的關鍵氧化步驟，從而闡明了柏科植物中這一重要酚性二萜的生物合成通路。其次，研究揭示了一個普遍存在的基因組特征：CYP720B與DTS基因在柏亞綱植物中以頭對頭的方式緊密連鎖，形成保守的基因對結構。
這一發現具有多重重要意義。在酶學機制上，TcLOs的功能與被子植物（如丹參）中催化類似反應的CYP76AH家族酶形成了鮮明的對比。盡管最終產物相似，但柏科和唇形科植物動用了進化上完全不同的P450家族來完成氧化步驟，這是功能趨同進化（convergent evolution）的一個典型例證，揭示了自然界中不同譜系獨立“發明”相似化學解決方案的奇妙現象。
在基因組與進化層面，研究提供的證據（包括基因對的廣泛分布、成對基因特有的系統發育聚類以及柏亞綱內保守的微共線性）強烈支持這樣一個觀點：CYP720B–DTS基因對結構在柏亞綱的共同祖先中就已建立，并在此后超過2億年的演化歷程中被長期保留下來。這種長期維持的基因緊密關聯，可能有利于協調基因表達、共同遺傳，從而優化二萜防御化合物的生產，為柏亞綱植物在歷史上經歷多次環境劇變（如二疊紀-三疊紀大滅絕事件）時提供了適應優勢。雖然部分松科植物也存在類似基因對，但其系統發育和基因組背景與柏亞綱不同，提示其可能獨立起源。
總之，這項研究不僅解析了具有生態和藥用價值的鐵銹醇的生物合成途徑，更首次在基因組尺度上揭示了針葉樹，特別是柏亞綱植物中，二萜生物合成基因的一種古老而保守的基因組構型。這為理解植物特殊代謝通路的進化、基因組組織與生態適應性之間的關聯提供了關鍵的新見解，也為未來利用合成生物學手段生產這些有價值的萜類化合物奠定了重要的分子基礎。
