《PROTEOMICS》：Single-Cell Nanodroplet Processing Proteomics Pipeline for Analysis of Human-Derived Microglia
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本文介紹了一種結合熒光激活細胞分選（FACS）、納升級液滴處理（nanoPOTS）與高場不對稱波形離子淌度譜-數據非依賴采集（FAIMS-DIA）質譜技術的創新工作流程，首次對人死后大腦皮層來源的小膠質細胞進行了無標記單細胞蛋白質組學（scProteomics）分析。該方法平均從單個小膠質細胞中鑒定出1039種蛋白質，證明了在單細胞水平探索小膠質細胞異質性的可行性，并揭示了驅動其變異的線粒體蛋白通路，為在阿爾茨海默病（AD）等神經系統疾病中識別功能相關蛋白靶點提供了新的工具和見解。
引言
小膠質細胞是中樞神經系統（CNS）的常駐免疫細胞，動態響應CNS損傷、感染和組織穩態。單細胞組學技術的發展揭示了小膠質細胞具有高度多樣性和異質性。盡管單細胞RNA測序（scRNA-Seq）和飛行時間流式細胞術（CyTOF）等研究已鑒定出多種小膠質細胞轉錄亞型，但這些方法提供的是蛋白質豐度的間接信息或有限數量的目標。鑒于許多神經病理是蛋白質驅動的，如Aβ斑塊、神經原纖維纏結等，單細胞蛋白質組學（scProteomics）有望為理解小膠質細胞異質性提供有價值的見解。本文首次提出一種結合熒光激活細胞分選（FACS）、低溫保存、壓電細胞分選、納升級液滴處理（nanoPOTS）和高場不對稱波形離子淌度譜-數據非依賴采集（FAIMS-DIA）質譜分析的工作流程，應用于人腦皮層來源的小膠質細胞，進行了無標記單細胞蛋白質組學分析。
實驗方法
材料與芯片制備
實驗所用試劑包括n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷（DDM）、碘乙酰胺（IAA）、碳酸氫銨（ABC）、甲酸（FA）、胰蛋白酶、Lys-C等。納升級液滴處理（nanoPOTS）芯片采用光刻、濕法刻蝕和硅烷化工藝制備，包含48個納米孔。芯片表面用全氟硅烷（PFDS）處理，形成被疏水表面環繞的親水納米孔。
人腦樣本來源與微膠質細胞分離
人腦樣本來源于一位83歲女性捐贈者的內側額葉皮質。小膠質細胞分離采用已發表的方法。組織樣本經過勻漿、過濾、Percoll密度梯度離心去除髓鞘碎片后，通過磁珠分選（MACS）富集CD11b+細胞，再利用FACS分選CD11b+/CD45+/7AAD?的細胞，分選后細胞在含40%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亞砜（DMSO）的RPMI-1640培養基中冷凍保存。
單細胞分選與納液滴樣本處理
使用CellenONE儀器進行壓電分選，將單個細胞沉積到nanoPOTS芯片的納米孔中。基于明場圖像實時分選，并設定細胞直徑和形態參數以排除碎片和細胞團。在芯片上進行樣本處理：加入含有DDM和DTT的提取緩沖液進行裂解和還原，再加入IAA進行烷基化，最后加入Lys-C和胰蛋白酶進行酶解，反應后被甲酸淬滅并干燥。
液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析與數據處理
使用配備FAIMS Pro接口的Orbitrap Astral質譜儀進行分析，采用數據非依賴采集（DIA）模式。原始數據通過Spectronaut軟件，使用DirectDIA+（無庫）策略搜索人類蛋白數據庫。對前體和蛋白進行嚴格質量控制（FDR < 1%）和過濾。缺失值插補后，通過主成分分析（PCA）探索數據變異來源，并使用基因本體（GO）術語富集分析功能通路。
結果
單細胞蛋白質組學（scProteomics）平臺與鑒定深度
該工作流程如圖1A所示。在缺失值插補前，從47個單個人源小膠質細胞中，平均鑒定出3290±1059個前體和1039±283個蛋白質（圖1B，C）。從人小膠質細胞系HMC3的單個細胞中鑒定到的蛋白數量更高。在至少50%的單個小膠質細胞中觀察到了50%的前體，顯示了較好的覆蓋度。鑒定到的蛋白質中包含CD45（PTPRC）、CD11b（ITGAM）等小膠質細胞標志物，以及5%的已知老化小膠質細胞（HuMi_Aged）富集蛋白（圖2）。
小膠質細胞與HMC3細胞的蛋白質組異質性
對小膠質細胞的主成分分析顯示，對第一主成分貢獻最大的蛋白質包括TUBB2A、TUBA4A、CAMK2A等，對第二主成分貢獻大的包括ATP1F1D、SLC25A4、PPT1等（圖3A，B）。分析發現，第一主成分與細胞直徑顯著相關。將蛋白質匯總到GO生物過程術語后進行PCA分析，發現導致小膠質細胞群體變異的主要通路是線粒體相關過程，包括呼吸、線粒體ATP合成和氧化磷酸化等（圖3C，D）。驅動這些GO術語的蛋白質包括NADH脫氫酶（復合物I）、細胞色素b-c1（復合物III）、細胞色素c氧化酶（復合物IV）、F1-ATPase（復合物V）和Na+/K+-ATPase復合物的成員。微管相關過程和有絲分裂也是重要的變異來源。對HMC3細胞的PCA分析則顯示，主要貢獻蛋白為各種組蛋白、SNRPB/N、SRSF7、APOC1和IPO4等（圖4A，B），GO富集分析則指向與真核翻譯起始因子、載脂蛋白、補體因子等相關的通路（圖4C，D）。細胞直徑僅與HMC3細胞的第三主成分相關。
討論
蛋白質組覆蓋度
本研究首次將無標記單細胞蛋白質組學應用于人死后腦皮層分離的單個小膠質細胞。小膠質細胞在死后活性迅速下降，且細胞尺寸小、蛋白質質量有限。通過FACS富集結合nanoPOTS技術，本研究實現了與單細胞RNA測序相當的鑒定數量，為在單細胞水平上研究小膠質細胞的轉錄和空間異質性開辟了新途徑。
單細胞小膠質細胞群體的蛋白質組變異性
結果表明，線粒體蛋白是解釋小膠質細胞個體間變異的關鍵因素。小膠質細胞在激活和分化過程中經歷能量代謝變化。靜息態小膠質細胞主要依賴氧化磷酸化，而促炎群體依賴有氧糖酵解，抗炎群體依賴線粒體氧化。本研究捕獲的這些與呼吸、質子跨膜轉運、線粒體ATP合成相關的GO術語，可能反映了這些代謝轉變。此外，細胞骨架蛋白（如微管蛋白）的變異與細胞大小相關，這也與之前關于細胞大小是單細胞蛋白質組變異主要來源的觀察一致。而在HMC3細胞中，細胞大小對變異的貢獻較小，且主成分解釋的總方差低于原代小膠質細胞，表明永生化的HMC3細胞在蛋白質組景觀上更為同質。
結論
本研究描述了一種用于分析人腦來源單個小膠質細胞的單細胞蛋白質組學（scProteomics）流程。該流程包括基于CD11b標記的細胞富集、FACS輔助分選、低溫保存、二次分選、nanoPOTS芯片處理及質譜分析。實現了平均每個細胞約1000種蛋白質的定量，與單細胞RNA測序水平相當。這種直接測量單細胞內全局蛋白質豐度的正交方法，將補充現有的轉錄組研究，揭示對理解小膠質細胞表型和亞型至關重要的獨特蛋白質表達模式，特別是在神經退行性疾病（如阿爾茨海默病）的背景下。
