2019年末，一場由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引發的疫情席卷全球。這種病毒狡猾地利用其表面的“鑰匙”——刺突蛋白(Spike)，去打開人體細胞表面的“鎖”——血管緊張素轉換酶2(ACE2)受體，從而實現入侵。入侵的終極一步，是病毒的外膜與宿主細胞的細胞膜發生融合，如同兩個肥皂泡合二為一，將病毒的遺傳物質釋放進細胞。然而，這個融合過程并非孤立發生，它深受細胞膜這個復雜“舞臺”的影響。細胞膜并非均一的脂質雙分子層，其中分布著像膽固醇這樣的關鍵分子。膽固醇不僅是維持膜結構穩定的“混凝土”，還能調控鑲嵌在膜中蛋白質的構象與功能。此前的研究已廣泛提示，膽固醇在包括SARS-CoV-2在內的多種包膜病毒入侵中扮演著重要角色，但其精確的調控機制，尤其是在病毒膜（而非宿主細胞膜）一側的具體作用方式，仍然籠罩在迷霧之中。特別是，刺突蛋白那個伸向病毒內部的“尾巴”——C端胞質區，它經歷了棕櫚酰化修飾（一種將脂肪酸鏈共價連接到蛋白質半胱氨酸殘基上的過程），被認為可能與脂筏（富含膽固醇和鞘脂的膜微區）相互作用，但這個區域如何在膽固醇感知和病毒入侵中發揮作用，幾乎未被探索。為了撥開這層迷霧，研究人員開展了一項深入研究，其成果發表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊。

為了揭示膽固醇在SARS-CoV-2入侵中的精確作用，研究人員綜合運用了多種前沿的生物物理與細胞生物學技術。他們首先建立了一個高度可控的體外重建系統，將純化的工程化刺突蛋白和ACE2蛋白分別重構到兩組脂質體上，模擬病毒膜和宿主細胞膜，從而實現了對膜脂組成的精確調控。在此基礎上，他們進行了囊泡-囊泡內容物混合的批量實驗和單囊泡成像分析，后者包括單囊泡錨定、脂質混合及內容物混合 assay，能夠分解并定量分析膜融合的不同子步驟（如docking和fusion pore opening）。在細胞水平，研究人員采用了細胞-細胞融合實驗（通過共培養表達Spike和ACE2的細胞觀察合胞體形成）和SARS-CoV-2假病毒感染實驗（通過熒光素酶報告基因檢測感染效率）來驗證生理相關性。為了在納米尺度觀察Spike蛋白的空間分布及其與膽固醇的共定位，他們使用了結構光照明顯微鏡(SIM)超分辨成像技術。最后，為了在單分子水平解析Spike蛋白的寡聚狀態，他們開發了基于位點特異性生物偶聯和單分子光漂白分析的方法，對重構在支撐脂雙層(SLB)或源自細胞膜的囊泡上的Spike蛋白進行定量計數。

研究人員構建了Spike¹²⁶⁸（一種C端截短5個氨基酸以增強表達的工程化Spike）囊泡和ACE2囊泡體系。批量融合實驗表明，當病毒膜（Spike囊泡）含有≥10 mol%的膽固醇時，Spike介導的囊泡-囊融合效率顯著提升。而在宿主膜（ACE2囊泡）一側增加膽固醇，對融合效率影響輕微，僅在極高濃度(50 mol%)時表現出抑制，這可能是膽固醇過載改變膜流動性所致。這表明膽固醇的促進作用主要源于病毒膜側。

為了區分膽固醇是影響了病毒與細胞的初始接觸（錨定）還是后續的膜合并（融合），研究人員進行了單囊泡實驗。單囊泡錨定實驗顯示，增加Spike囊泡中的膽固醇含量，能顯著提高其與ACE2囊泡的錨定概率。然而，在單囊泡內容物混合（反映完整膜融合）實驗中，膽固醇水平的變化并未改變融合孔打開的概率。這表明，膽固醇主要通過促進病毒膜與宿主細胞膜的初始錨定來提升整體融合效率，而對錨定后的融合動力學步驟影響甚微。

在細胞-細胞融合模型中，使用甲基-β-環糊精(MβCD)耗竭表達Spike的細胞膜上的膽固醇，可顯著抑制合胞體形成；而用MβCD-膽固醇復合物(MβCD-CHO)補充膽固醇后，融合能力得以恢復。類似地，用MβCD預處理SARS-CoV-2假病毒以耗盡其膜膽固醇，會顯著降低病毒感染力；補充膽固醇則能增強感染，并呈現出劑量依賴性的促進或抑制效應。這些結果在更接近生理的環境中印證了膽固醇對Spike介導膜融合的關鍵作用。

為了探究膽固醇促進錨定的機制，研究人員利用SIM超分辨成像觀察了細胞膜上Spike蛋白的分布。他們發現，在膽固醇充足的細胞膜上，Spike蛋白傾向于形成密度更高、直徑更大的簇狀結構；而在膽固醇耗竭的膜上，Spike的分布則更為分散。這表明膽固醇能驅動Spike蛋白在膜上發生空間重排，形成納米尺度的聚集。

通過單分子光漂白技術，研究人員在單分子水平對Spike蛋白的寡聚狀態進行了定量。他們將一個Q3肽標簽基因插入到Spike¹²⁶⁸的N端（Spike^1268_Q3），并利用微生物轉谷氨酰胺酶(gpTGase)進行位點特異性Cy5熒光標記。將該蛋白重構到含有或不含膽固醇的支撐脂雙層(SLB)上，或使用經膽固醇調控的細胞膜制備的SLB進行分析。結果顯示，在富含膽固醇的膜環境中，每個Spike蛋白簇中包含的Spike單體拷貝數顯著多于膽固醇缺失的膜環境。這直接證明了膽固醇能誘導Spike蛋白形成更高階的寡聚體。

研究人員構建了胞質區截短的Spike突變體（Spike¹²³⁴）。在單囊泡錨定實驗中，Spike¹²³⁴囊泡失去了膽固醇對錨定的增強作用。SIM成像和Pearson相關性分析顯示，與全長Spike¹²⁶⁸相比，Spike¹²³⁴與膽固醇的共定位顯著減弱，且其簇狀結構的形成不再受膽固醇水平的調控。在細胞-細胞融合實驗中，Spike¹²³⁴介導的合胞體形成也對膽固醇調制不敏感。這些結果表明，Spike蛋白的C端胞質區是感知膜膽固醇并介導其依賴性功能的關鍵模塊。

Spike蛋白胞質區內含有一個富含10個半胱氨酸的保守區域(CRR)，是棕櫚酰化的位點。研究人員將CRR中的所有半胱氨酸突變為丙氨酸，構建了突變體Spike^1268_10A。該突變體喪失了與膽固醇的直接結合能力。在功能上，Spike^1268_10A介導的囊泡融合、細胞融合均不再受膽固醇水平的調節。SIM成像顯示其無法形成膽固醇依賴性的簇狀結構，單囊泡錨定實驗中也觀察不到膽固醇的增強效應。此外，用棕櫚酰化抑制劑2-溴棕櫚酸(2-BP)處理假病毒，能劑量依賴性地抑制病毒感染。這些數據強有力地證明，CRR的棕櫚酰化修飾是Spike蛋白與膽固醇相互作用、進而形成功能性寡聚簇所必需的。

本研究通過多層次的實驗體系，系統闡明了膽固醇在SARS-CoV-2入侵中的精確分子機制。核心結論是：位于病毒膜上的膽固醇，通過與Spike蛋白C端胞質區內棕櫚酰化的CRR特異性相互作用，誘導Spike蛋白發生橫向重組，形成高階寡聚簇。這種空間納米級的重組裝，猶如在病毒表面組建了一個個“登陸平臺”，通過多價的ACE2受體結合，極大地增強了病毒膜與宿主細胞膜的初始錨定效率，從而為后續的膜融合與病毒入侵鋪平道路。

該研究的科學意義重大。首先，它將膽固醇對病毒入侵的促進作用精確鎖定在“病毒膜”這一特定空間，并解析了其通過“Spike蛋白胞質尾”這一特定分子模塊起作用，突破了以往將膽固醇作用籠統歸因于脂筏或膜流動性的認知。其次，研究發現了膽固醇驅動Spike蛋白寡聚化這一此前未知的調控機制，為理解包膜病毒融合蛋白的活化和組織提供了新視角。最后，也是最具轉化潛力的，是研究明確了CRR及其棕櫚酰化修飾是膽固醇依賴的病毒入侵的關鍵樞紐。鑒于CRR在SARS-CoV-2及其變異株乃至其他冠狀病毒中的高度保守性，針對這一相互作用的干預（如開發抑制棕櫚酰化或競爭性結合CRR的多肽/小分子），有望成為一種不依賴于Spike受體結合域(RBD)、具有廣譜抗冠狀病毒潛力的全新治療策略。同時，研究也為臨床上探索使用安全性更高的環糊精衍生物（如HP-β-CD）通過耗竭病毒膜膽固醇來抑制感染提供了更深層的理論依據。總之，這項研究不僅增進了對冠狀病毒基礎生物學的理解，也為應對當前及未來可能的冠狀病毒威脅指明了新的藥物研發方向。