《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Extraocular delivery of bioswitchable tri-miR-22-loaded tetrahedral DNA nanostructures for intraocular neovascular and neurodegenerative repair
編輯推薦：
當前抗VEGF療法雖可抑制眼底新生血管滲漏，但存在對神經退行性病變無效、無法改善視網膜灌注、需頻繁玻璃體腔注射等局限。研究人員開發了一種基于四面體框架DNA（tFNAs）的生物可切換三重miR-22模擬物遞送系統（BiRDS），通過結膜下給藥實現藥物穿透，在動物模型中證實其不僅能有效抑制病理性新生血管，還可促進健康血管重塑、保護視網膜神經元及功能。該研究為眼科神經血管疾病提供了一種全新的、微創、多靶點治療策略。
在眼科疾病領域，如糖尿病視網膜病變和濕性年齡相關性黃斑變性，異常血管生長和滲漏常常是視力喪失的直接原因。多年來，向眼球內注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物已成為臨床控制這類新生血管性疾病的主流手段，挽救了無數患者的視力。然而，這種“狙擊”VEGF的療法并非萬能。高達30%-50%的患者反應不佳，提示還有其他病理信號通路在“作祟”。更重要的是，現有療法本質上只針對血管異常，對伴隨發生的視網膜神經元損傷束手無策，無法修復已經受損的神經功能。此外，頻繁的眼內注射本身存在眼內炎等風險，給患者帶來身心負擔和治療依從性難題。那么，有沒有一種方法，能夠“一箭雙雕”，同時抑制病理性血管生長并保護脆弱的神經元，而且還能避免反復的眼內穿刺呢？
為了回答這個問題，來自中山大學中山眼科中心與四川省人民醫院的研究團隊在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上發表了一項創新性研究。他們巧妙地將目光投向了microRNA-22（miR-22，一種具有抑制血管新生和神經保護雙重潛能的微小RNA）和四面體框架核酸（tFNAs，一種具有優異生物相容性和細胞穿透能力的DNA納米結構），設計并構建了一種名為“基于四面體框架DNA的生物可切換三重miR-22模擬物遞送系統”，簡稱BiRDS。這個系統就像一輛精心設計的“智能納米卡車”：其骨架是穩定的tFNA四面體結構，內部裝載了三份miR-22模擬物“貨物”，并通過特殊的DNA-RNA雜合“開關”設計，確保“貨物”在進入細胞后能被特定的酶（RNase H）觸發釋放，從而精準發揮作用。
為開展此項研究，研究人員運用了多項關鍵技術。在納米載體構建與表征方面，他們通過一鍋法退火自組裝合成BiRDS，并利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、透射電子顯微鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）和動態光散射（DLS）驗證了其成功組裝、形貌、尺寸和電位。在細胞與動物模型驗證中，研究采用了人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的缺氧模型，通過CCK-8、EdU摻入、Transwell小室和成管實驗評估BiRDS的細胞活性和抗血管生成能力；并建立了激光誘導的脈絡膜新生血管（CNV）小鼠/大鼠模型以及氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠模型，通過熒光素眼底血管造影（FFA）、光學相干斷層掃描（OCT）、視網膜鋪片免疫熒光染色、視網膜切片免疫組化及視網膜電圖（ERG）等手段，在體評價了BiRDS經結膜下給藥后的眼內分布、治療效果（抑制病理性血管、促進生理性血管、保護神經元）及對視功能的影響。在機制探索層面，研究人員對經BiRDS處理的HUVECs進行了RNA測序（RNA-seq）分析，并結合定量聚合酶鏈反應（qPCR）、蛋白質印跡（Western blot）和免疫熒光染色，從轉錄組和蛋白水平驗證了其作用的核心信號通路。
研究結果部分歸納如下：
BiRDS的合成與表征
研究人員成功合成了BiRDS。電泳、TEM和AFM證實其形成了預期的四面體納米結構，DLS顯示其尺寸約為15.19 nm，攜帶負電荷。細胞實驗表明，Cy5標記的BiRDS能在24小時內有效被HUVECs攝取并積累在細胞質中。
BiRDS在體外抑制缺氧誘導的HUVEC增殖、遷移和病理性血管生成
在缺氧條件下，BiRDS能顯著抑制HUVECs的增殖（EdU實驗）、遷移（Transwell實驗）和體外成管能力，其效果與臨床一線抗VEGF藥物阿柏西普（Aflibercept, AFL）相當，而單獨的miR-22或tFNAs載體效果有限。
眼內（玻璃體腔）給藥的BiRDS有效抑制激光誘導的CNV
在大鼠激光誘導CNV模型中，玻璃體腔注射BiRDS能在第14天和第21天顯著減小CNV病灶面積和滲漏，其抑制效果與AFL組相當。
結膜下給藥的BiRDS可實現眼內穿透和視網膜靶向：從眼內給藥到眼外給藥的跨越
這是本研究的關鍵突破。Cy5標記的BiRDS經小鼠結膜下注射后，能有效穿透眼部屏障。熒光成像顯示，藥物在1小時內即可在脈絡膜檢測到，6小時后在視網膜出現，并在18小時內持續分布。這表明BiRDS能夠通過“鞏膜-脈絡膜-視網膜”途徑到達眼底靶組織，實現微創的結膜下給藥替代侵入性的玻璃體腔注射。
靶向脈絡膜的結膜下給藥BiRDS抑制CNV
在小鼠激光CNV模型中，結膜下注射BiRDS能顯著減小CNV病灶的滲漏面積（FFA評估）和病灶尺寸（OCT評估），療效與玻璃體腔注射AFL相當，且優于單獨的miR-22或tFNAs載體。
靶向脈絡膜的結膜下給藥BiRDS抑制視網膜新生血管（RNV）
在OIR模型中，結膜下給予BiRDS能有效減少視網膜病理性新生血管區域，效果與AFL相當。更重要的是，BiRDS還能顯著縮小視網膜無灌注區（avascular area），而AFL對此無明顯改善，這顯示了BiRDS在緩解視網膜缺血、促進生理性血管再灌注方面的獨特優勢。
結膜下給藥的BiRDS抑制病理性血管出芽并促進健康血管生成
BiRDS治療減少了OIR視網膜中從靜脈異常出芽的血管面積。同時，它增加了血管生長前沿的內皮尖端細胞（tip cell）數量和絲狀偽足（filopodia）延伸，這表明BiRDS在抑制病理性血管的同時，還能促進健康的生理性血管重建。
結膜下給藥的BiRDS在OIR模型中保護視網膜神經元
缺氧缺血會導致視網膜神經節細胞（RGCs）凋亡和膠質細胞活化。免疫熒光結果顯示，BiRDS治療顯著降低了膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達（表明減輕了膠質細胞活化），并保留了更多的Tuj1+神經節細胞、PKC-α+雙極細胞、視紫紅質（Rhodopsin）+視桿細胞和鈣結合蛋白（Calbindin）+水平細胞。這表明BiRDS對多種類型的視網膜神經元具有廣泛的保護作用。
結膜下給藥的BiRDS保護視網膜神經功能
ERG檢測從功能層面驗證了神經保護效果。與對照組相比，BiRDS治療組小鼠的暗適應（視桿細胞主導）和明適應（視錐細胞主導）ERG的a波、b波振幅，以及振蕩電位（OPs）振幅均得到顯著增強，表明其視網膜光感受器、雙極細胞及內層視網膜的神經信號傳導功能得到了更好的保留。
轉錄組分析揭示BiRDS通過調節Wnt通路介導神經血管保護
RNA-seq分析發現，BiRDS處理逆轉了缺氧引起的許多基因表達變化，其中經典Wnt/β-連環蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路的相關基因富集顯著。qPCR和Western blot驗證進一步證實，BiRDS能下調該通路關鍵分子Frizzled 4（FZD4）和β-catenin的mRNA及蛋白表達，同時上調糖原合酶激酶3β（GSK3β）的表達。在OIR小鼠視網膜中也觀察到了相同的蛋白表達變化模式。這表明，BiRDS通過遞送miR-22，抑制了Wnt/β-catenin信號通路的過度激活，這可能是其同時發揮抗血管新生和神經保護雙重功效的核心分子機制。
結論與討論歸納：
本研究成功開發并驗證了BiRDS這一創新的納米遞送平臺。其重要意義在于實現了多個維度的突破：在給藥途徑上，首次證實了基于tFNA的核酸藥物可通過結膜下這種微創、門診可操作的方式，有效穿透眼球屏障到達眼底視網膜，為替代頻繁、有創的玻璃體腔注射提供了全新方案。在治療效能上，BiRDS不僅表現出與現有抗VEGF藥物相當的抑制病理性新生血管的能力，更具備了當前療法缺乏的獨特優勢——促進健康的生理性血管重建以改善視網膜灌注，以及全面保護視網膜神經元結構和功能，真正實現了對“視網膜神經血管單元”的綜合修復。在作用機制上，研究揭示了其通過調節Wnt/β-catenin這一在多種眼病中關鍵的信號通路，來協調發揮血管和神經保護作用。
總之，BiRDS代表了一種從單純“抗血管”到“神經血管綜合修復”的范式轉變。它通過一個微創的給藥平臺，將一個具有多靶點調控潛力的治療分子（miR-22）高效遞送至病灶，同步應對眼底疾病的血管異常和神經退行兩大核心病理過程。這項工作為治療糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性等頑固性致盲眼病，提供了一個極具臨床轉化前景的下一代RNA納米治療策略。
