《Agroecology and Sustainable Food Systems》：Compost toilet leachate promotes plant growth comparably to traditional fertilizers without altering root microbiome
引言：傳統(tǒng)廢水管理的挑戰(zhàn)與可持續(xù)替代方案
全球約有34億人無法獲得安全管理衛(wèi)生設(shè)施，每年導(dǎo)致約140萬人死亡。在高收入國家，雖然集中式污水處理系統(tǒng)和水處理技術(shù)大幅減少了水媒和衛(wèi)生相關(guān)疾病，但這些方法存在顯著缺陷，包括無法去除廢水中的許多合成化學(xué)物質(zhì)，如全氟和多氟烷基物質(zhì)（PFAS）等。此外，處理廠在暴雨或機(jī)械故障期間會(huì)例行排放未經(jīng)處理的廢水，每年約有4.5萬億升未經(jīng)處理的污水流入美國水體。這導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)和相關(guān)污染物進(jìn)入水道，使水質(zhì)惡化，并造成人類健康風(fēng)險(xiǎn)。與此同時(shí)，污水處理也是溫室氣體排放的重要來源，并消耗大量資源。因此，堆肥廁所等衛(wèi)生技術(shù)提供了有前景的解決方案。
由馬薩諸塞州公司Clivus Multrum制造的堆肥廁所系統(tǒng)，提供了一種可持續(xù)的傳統(tǒng)廢水管理替代方案。與化糞池或集中式下水道不同，Clivus Multrum系統(tǒng)可以在有水或無水、有電或無電的情況下運(yùn)行。其設(shè)計(jì)將衛(wèi)生紙、排泄物與木屑等碳源結(jié)合，經(jīng)過數(shù)年時(shí)間降解。一個(gè)假底位于儲(chǔ)罐底部，允許多余的滲濾液排出并收集在一個(gè)獨(dú)立的隔間，從而產(chǎn)生一種營養(yǎng)豐富的液體（滲濾液）和一個(gè)固體部分（“堆肥”）。
使用Clivus Multrum廁所產(chǎn)生的滲濾液可以轉(zhuǎn)變對傳統(tǒng)肥料的依賴，并有助于閉合養(yǎng)分循環(huán)。然而，美國聯(lián)邦立法禁止將人類排泄物用于農(nóng)業(yè)目的，除非獲得州政府特別許可。這一法律障礙限制了對人類排泄物作為植物可利用養(yǎng)分來源的科學(xué)評估，并造成了關(guān)于使用Clivus滲濾液作為肥料時(shí)其農(nóng)藝和微生物影響的知識(shí)空白。
相比之下，污水污泥和生物固體是廢水處理廠的固體副產(chǎn)品，處理來自工業(yè)和住宅來源的混合廢物流。雖然營養(yǎng)豐富，但已知生物固體和污泥含有重金屬、藥物和環(huán)境污染物，如微塑料和PFAS物質(zhì)。研究表明，當(dāng)它們被施用于農(nóng)田時(shí)，會(huì)對土壤健康、水質(zhì)和食品安全產(chǎn)生不利影響。作為回應(yīng)，美國已有兩個(gè)州和幾個(gè)縣頒布了在農(nóng)業(yè)中使用這些材料的禁令。此外，佛蒙特州的Rich Earth Institute等團(tuán)體正在探索源頭分離衛(wèi)生系統(tǒng)，如尿液分流，作為一種主動(dòng)策略，從源頭回收養(yǎng)分并防止工業(yè)副產(chǎn)品的污染。
與僅收集和處理人類排泄物液體部分的尿液分流系統(tǒng)不同，Clivus Multrum廁所通過在傾斜的儲(chǔ)存罐中將排泄物、衛(wèi)生紙和富碳填充劑結(jié)合，共同堆肥液體和固體廢物。常見的填充劑在溫帶地區(qū)是松木刨花，在熱帶地區(qū)是椰子殼纖維/海藻。傾斜的設(shè)計(jì)允許尿液滲透通過堆肥物質(zhì)，然后被收集在單獨(dú)的隔間中。當(dāng)尿液通過料堆時(shí)，尿素被轉(zhuǎn)化為銨，銨可能通過土著微生物發(fā)生硝化作用轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。盡管Clivus系統(tǒng)達(dá)不到嗜熱溫度，但較長的停留時(shí)間、穩(wěn)定的曝氣和高微生物多樣性有助于養(yǎng)分穩(wěn)定和病原體減少。此外，缺少嗜熱步驟可能有助于保存有益的微生物，如植物促生菌（PGPR）。盡管其作為可持續(xù)肥料的潛力，但圍繞排泄物改良劑的法規(guī)限制了科學(xué)評估Clivus滲濾液對土壤、作物和微生物群落的影響。本研究通過評估Clivus滲濾液的代謝和化學(xué)特性，并檢驗(yàn)其在農(nóng)業(yè)環(huán)境中應(yīng)用時(shí)的農(nóng)藝和微生物影響，來解決這些知識(shí)空白。
方法
目標(biāo)1. 表征Clivus滲濾液的化學(xué)和代謝特性
滲濾液樣品于2022年10月從三個(gè)州（VT, NY, MA）的Clivus Multrum系統(tǒng)中收集，共選擇了11個(gè)廁所。在每個(gè)地點(diǎn)，從每個(gè)廁所的收集池中采集約1升滲濾液樣品，密封在密閉容器中并于4°C儲(chǔ)存。對每個(gè)滲濾液樣品進(jìn)行了一系列分析以表征其化學(xué)性質(zhì)，包括使用pH計(jì)測量酸度，使用電導(dǎo)率儀測量電導(dǎo)率以評估鹽度。通過氯化鉀（KCl）提取硝酸鹽和銨，并使用流動(dòng)注射分析系統(tǒng)進(jìn)行定量。其他養(yǎng)分在pH 4.8的乙酸銨（改良摩根溶液）中以1:5（體積比）提取15分鐘。磷通過比色流動(dòng)注射分析測定，其他養(yǎng)分通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測量。
來自兩個(gè)維護(hù)方法不同的Clivus廁所的滲濾液樣品，被比較微生物活性和代謝多樣性。一個(gè)樣品來自Churchtown Dairy，代表一個(gè)高使用率的公共設(shè)施；另一個(gè)來自一個(gè)向儲(chǔ)罐添加適量食物殘?jiān)淖≌攸c(diǎn)。使用EcoPlates測量滲濾液樣品中的微生物活性和代謝多樣性。每個(gè)板包含一組不含碳的對照和31種碳源。將樣品移入孔中，在25°C黑暗環(huán)境中培養(yǎng)6天，并使用微孔板分光光度計(jì)讀取590 nm處的光密度。計(jì)算平均代謝響應(yīng)和群落代謝多樣性。
大腸桿菌存活
將Clivus滲濾液樣品用作培養(yǎng)基，作為大腸桿菌存活的通用測試。制備松木刨花提取物作為對照。將三重抗利福平大腸桿菌菌株混合物添加到從佛蒙特州各廁所收集的Clivus滲濾液樣品中。將樣品在35°C下?lián)u動(dòng)，并在接種后0、5、20、29、48、98、120和168小時(shí)通過涂布平板法計(jì)數(shù)。通過線性混合效應(yīng)模型分析存活率。
目標(biāo)2. 對番茄和大麻植物生長和養(yǎng)分含量的影響
在連續(xù)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中評估了Clivus滲濾液作為肥料和可能的天然生物刺激劑促進(jìn)植物生長的能力。這些實(shí)驗(yàn)使用的滲濾液來自一個(gè)地點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)1旨在量化施用三種不同劑量（56、112、168千克N/公頃）Clivus滲濾液施肥的番茄幼苗的生長情況，并與兩種對照肥力類型（均施用112千克N/公頃）進(jìn)行比較。一種對照是商業(yè)合成肥料，第二種對照是經(jīng)過高溫堆肥并在流通式蚯蚓箱中腐熟的蚯蚓堆肥。將兩周大的番茄幼苗移栽到裝有巴氏滅菌土壤的盆中。在種植前手動(dòng)將蚯蚓堆肥混入土壤，其他處理在移栽后立即施用。液體肥料處理在第0天和第7天以半劑量施用。每周測量植物物候，直到第21天破壞性采樣，以量化根冠比并收集根系微生物組樣品。此外，從每株植物收集最新成熟的葉片樣品以評估養(yǎng)分含量。
實(shí)驗(yàn)2重復(fù)了第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，但使用纖維大麻種子直接播種到裝有巴氏滅菌田間土壤的塑料盆中。種植一周后，將全劑量液體肥料處理澆入幼苗。在第0、5、10和15天記錄株高和葉片數(shù)量，在第15天測量莖粗并進(jìn)行破壞性采樣和相同分析。使用單向方差分析（ANOVA）分析處理對每種植物物種生長的影響。
目標(biāo)3. 肥料處理對番茄和大麻根系微生物組的影響
在生長試驗(yàn)的最后一天，從施用蚯蚓堆肥、合成養(yǎng)分和112千克N/公頃Clivus的植物中收集微生物組樣品。根據(jù)空間梯度將微生物組樣品細(xì)分為根際、根表和內(nèi)根圈。對每個(gè)樣品的細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行分析。通過PMA光解和DNA提取處理樣品，然后對細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因V4區(qū)以及真菌的ITS1間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子測序。使用DADA2流程進(jìn)行序列質(zhì)量控制并聚類為擴(kuò)增子序列變異。使用貝葉斯分類器針對參考數(shù)據(jù)庫分配分類。整合數(shù)據(jù)并進(jìn)行群落組成差異檢驗(yàn)。
目標(biāo)4. 大規(guī)模施用對飼料質(zhì)量和生產(chǎn)力的影響
在2023年和2024年于Old Mud Creek Farm進(jìn)行了田間試驗(yàn)，評估Clivus滲濾液施用對干草產(chǎn)量和飼料質(zhì)量的影響。該干草地由冷季禾草組成。將滲濾液以三種不同氮素用量和兩種不同施用方式（一次全量或分兩次各50%）施用。每次收獲時(shí)，評估干草產(chǎn)量、飼料養(yǎng)分和質(zhì)量指標(biāo)。采用雙向方差分析（ANOVA）分析處理和施用方式對每次收獲的干草產(chǎn)量和飼料質(zhì)量的影響。
結(jié)果
目標(biāo)1. Clivus滲濾液的化學(xué)和代謝特性表征
滲濾液pH值適合植物生長（范圍：6.4–7.5）。電導(dǎo)率在樣品間存在差異，并且是氮含量的良好預(yù)測指標(biāo)。氮主要以銨的形式存在。來自住宅地產(chǎn)的滲濾液樣品平均代謝多樣性比Churchtown Dairy的樣品高60%。兩個(gè)樣品都顯示出與氨基酸和復(fù)雜碳水化合物降解相關(guān)的代謝活動(dòng)。Churchtown Dairy滲濾液的代謝譜更專門化，而住宅滲濾液顯示出更廣泛的代謝能力，這可能反映了食物垃圾的添加。
大腸桿菌存活
滲濾液樣品不支持大腸桿菌混合物的存活。在所有樣品中，接種后大腸桿菌種群迅速下降，松木刨花對照在24小時(shí)后未檢測到細(xì)胞，所有滲濾液樣品在168小時(shí)后完全死亡。與滲濾液相比，填充劑提取物在所有時(shí)間點(diǎn)的大腸桿菌存活率都較低，證實(shí)單獨(dú)的填充劑提取物無法維持細(xì)菌。三種滲濾液來源之間的大腸桿菌存活率相似。總體而言，這些結(jié)果表明本研究中分析的Clivus滲濾液樣品不提供有利于大腸桿菌存活的條件。
目標(biāo)2. 對植物生長和養(yǎng)分含量的影響
對于施用Clivus滲濾液和對照組的植物，大多數(shù)生長指標(biāo)在番茄和大麻中相似。處理對株高、莖粗、根冠比、葉片和花朵數(shù)量以及葉片養(yǎng)分的影響在兩種植物物種中都很小，但在番茄植物中檢測到細(xì)微差異。
植物物候：番茄和大麻的株高和葉片數(shù)量在所有處理間隨時(shí)間變化相似。番茄花朵數(shù)量在第21天一般隨著Clivus滲濾液施氮量的增加而下降，但處理間花朵數(shù)量的差異很小。施用合成肥料的番茄植株莖粗比用蚯蚓堆肥或Clivus滲濾液生長的植株粗約20%。大麻植株的莖粗不因處理而異。施用56千克N/公頃Clivus滲濾液的番茄植株的根冠比值大于施用合成肥料的植株。這種效應(yīng)在大麻植株中未觀察到。
葉片養(yǎng)分：施用112或168千克N/公頃Clivus滲濾液的番茄植株，其葉片氮和磷含量相似，但鉀含量高于用合成肥料生長的植株。這種效應(yīng)在大麻植株中未觀察到。用蚯蚓堆肥施肥的番茄植株鈣含量最高。用Clivus滲濾液或蚯蚓堆肥生長的植株，其鈉含量高于用合成肥料生長的植株。與對照組相比，用Clivus滲濾液處理的大麻和番茄植株的錳含量更高，并且通常隨著滲濾液施氮量的增加而增加。施用Clivus或合成肥料的番茄植株葉片鋅濃度高于在蚯蚓堆肥中生長的植株。所有其他微量養(yǎng)分和重金屬在處理間相似。
目標(biāo)3. 肥料處理對番茄和大麻根系微生物組的影響
施用Clivus滲濾液并未顯著改變兩種植物的微生物組組成。Clivus在植物生長和根系微生物組影響方面與合成肥料處理最為相似，但總體上處理和微生物生境間的差異很小。
細(xì)菌群落組成：總體上，處理間群落組成的最大變異發(fā)生在根際，并隨著接近根部而減小。Clivus產(chǎn)生的微生物群落與合成肥料最為相似，盡管處理對細(xì)菌組成的影響對兩種植物物種都相對較小。
在根際，Clivus和合成肥料處理中的細(xì)菌群落無法區(qū)分，但與兩種植物物種中的蚯蚓堆肥不同。番茄根表群落在所有處理間都有差異，而在大麻中，只有Clivus和蚯蚓堆肥不同。在內(nèi)根圈，大麻中蚯蚓堆肥群落與Clivus和合成處理都不同。相比之下，番茄內(nèi)根圈在Clivus和合成處理間有差異，但兩者都與蚯蚓堆肥相似。
放線菌、芽孢桿菌、浮霉菌、α-和γ-變形菌、疣微菌和擬桿菌是番茄和大麻植物各微生物生境中的主要分類類別。通常，芽孢桿菌、浮霉菌和疣微菌的相對豐度從內(nèi)根圈到根際增加。γ-變形菌和擬桿菌則相反。α-變形菌和放線菌沒有一致的空間模式。
Clivus和合成肥料支持相似的微生物群落，特別是在根際相對于蚯蚓堆肥。在番茄中，與蚯蚓堆肥相比，Clivus和合成處理增加了細(xì)菌類別芽孢桿菌、嗜熱油菌和放線菌的豐度。相反，與Clivus相比，噬纖維菌和Vicinamibacteria在蚯蚓堆肥下富集。在番茄根表，蚯蚓堆肥和合成處理下的擬桿菌比Clivus更豐富，而內(nèi)根圈沒有差異豐富的類群。
在大麻根際，在Clivus和合成肥料處理下觀察到相似的微生物群落，而芽孢桿菌和酸桿菌在蚯蚓堆肥處理中更豐富。在大麻根表或內(nèi)根圈群落中未觀察到差異類群。
真菌群落組成：用Clivus生長的植物的真菌群落與合成肥料處理相當(dāng)，而蚯蚓堆肥則更為獨(dú)特。具體而言，合成肥料組的根際群落與大麻植物的蚯蚓堆肥不同，番茄也是如此。Clivus處理的ITS群落與兩種植物根際的蚯蚓堆肥都不同。然而，在根表和內(nèi)根圈微生物生境中，沒有檢測到處理和植物類型之間的差異。
子囊菌、擔(dān)子菌和被孢霉主導(dǎo)了番茄和大麻所有根區(qū)的真菌群落。子囊菌包括豐富的科，如曲霉科、毛殼菌科、麥角菌科、肉座菌科和叢赤殼科。曲霉科通常在Clivus和合成肥料處理的根際和根表中富集。毛殼菌科、麥角菌科、肉座菌科和叢赤殼科在Clivus和合成處理下的內(nèi)部根區(qū)也更普遍。只有被孢霉科存在差異豐富，在蚯蚓堆肥和Clivus處理的番茄和大麻植物的根際中富集，與合成肥料相比。沒有其他類群顯示出處理差異。
目標(biāo)4. 田間規(guī)模施用對飼料生產(chǎn)力的影響
與未改良地塊相比，增加Clivus滲濾液的施氮量提高了干草產(chǎn)量和鉀含量。由于收獲前生長期較長，第二次收獲的產(chǎn)量高于第一次收獲；然而，處理效應(yīng)遵循相似的模式。氮素施用量是對飼料質(zhì)量和產(chǎn)量影響的主要驅(qū)動(dòng)因素，而施用方式?jīng)]有顯著影響。
收獲1：與未施肥對照地塊相比，施用中等和高氮量Clivus滲濾液的地塊干草產(chǎn)量更高。具體而言，以分次增量施用高劑量的地塊產(chǎn)量高于對照，而一次全量施用則沒有這種效果。對于接受中等劑量滲濾液的地塊，一次全量施用比對照產(chǎn)量更高，而分次施用沒有顯示差異。總之，較高的施氮量總體上提高了產(chǎn)量，而施用時(shí)間（一次 vs. 分次施用）的影響不太一致。干草的鉀含量與Clivus滲濾液提供的施氮量呈正相關(guān)，并且在施用全量或分次90千克N/公頃的地塊中高于未改良對照地塊。所有其他養(yǎng)分在處理間相似。此外，處理間在粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、非纖維碳水化合物、相對飼用價(jià)值或總可消化養(yǎng)分方面未檢測到主要差異。
收獲2：更高的施氮量與更高的干草產(chǎn)量相關(guān)。例如，施用高劑量滲濾液比對照地塊產(chǎn)生更高的干草產(chǎn)量。沒有發(fā)現(xiàn)顯著的成對處理組合。對于接受高劑量的地塊，無論滲濾液是一次還是分次施用，產(chǎn)量都相同。同樣，對于中等劑量，
