《Bioactive Materials》：Sustained release PLGA microspheres loaded with a bone-affinity Bmp2 enhance fracture healing and mitigate heterotopic ossification
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本研究旨在解決骨形態發生蛋白2（Bmp2）臨床應用面臨的體內穩定性差、半衰期短及誘發異位骨化風險高的問題。研究人員通過將Bmp2與骨親和肽（DSS6）融合，并封裝于多孔PLGA微球中，構建了D-Bmp2@M系統。該“緩釋-分子錨定”協同策略使Bmp2在保留生物活性的同時獲得了高骨組織親和力，實現了長達約30天的穩定緩釋，顯著促進了骨質疏松性骨折愈合，并有效降低了異位骨化風險，為骨折治療提供了新策略。
骨折，特別是像骨質疏松性骨折這類難以愈合的骨折，是臨床上面臨的一大挑戰。常規手術效果有限，而一種被稱為骨形態發生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2， Bmp2）的、被美國FDA批準的骨生長因子，雖有強大促成骨潛力，但臨床應用卻“束手束腳”。這主要有兩大“攔路虎”：其一，Bmp2個頭小、半衰期短，在體內代謝快，難以維持骨折愈合所需的長效治療濃度；其二，它缺乏組織特異性，容易從骨折部位“溜”到周圍肌肉組織中，錯誤地誘導肌肉干細胞“轉行”變成骨細胞，形成不該有的骨頭，也就是“異位骨化”，發生率可高達約70.1%。現有的單一策略，無論是開發緩釋系統延長作用時間，還是添加靶向分子增強骨組織富集，都無法同時解決空間（靶向）和時間（長效）這兩個維度的難題。
為了解決這一瓶頸，來自首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院關節外科的研究團隊在《Bioactive Materials》上發表了一項創新研究，他們提出了一種“緩釋-分子錨定”的協同策略，成功構建了一種新型的載藥系統——D-Bmp2@M。該系統將Bmp2與一種骨親和肽（由6個重復的Asp-Ser-Ser序列組成，即DSS6）融合，形成D-Bmp2，再將其封裝到具有“自愈合”能力的多孔聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic acid)， PLGA）微球中。這個精巧的設計旨在“一箭雙雕”：一方面，通過PLGA微球的緩慢降解，實現D-Bmp2長達約30天的持續釋放，匹配骨折愈合的關鍵時間窗；另一方面，利用DSS6肽對骨組織主要成分羥基磷灰石的高親和力，將釋放出的D-Bmp2“錨定”在骨折部位，減少其向周圍軟組織的擴散，從而在加速愈合的同時降低異位骨化風險。
為開展研究，作者運用了多項關鍵技術方法。首先，通過分子克隆和細胞（HEK293T）表達系統制備并純化了Bmp2和D-Bmp2融合蛋白，利用圓二色光譜、Bmp2報告基因系統和細胞實驗驗證了其結構、生物活性及骨親和力。其次，采用雙乳化-自愈合技術制備了負載蛋白的多孔PLGA微球，通過掃描電鏡、共聚焦顯微鏡、體外釋放實驗及生物活性檢測，表征了其形貌、載藥性能、長達30天的緩釋特性及釋放蛋白的活性保持。再次，建立了體外Transwell共培養模型（包括成骨細胞-骨模型和肌細胞-骨模型）來模擬評估系統的靶向促成骨和減少異位成骨分化的能力。最后，在動物水平，研究構建了小鼠股骨橫斷骨折模型和去卵巢（OVX）誘導的骨質疏松性骨折模型，通過局部注射不同制劑，綜合運用X射線、Micro-CT三維重建、組織學染色（H&E、Masson）、免疫熒光組化等技術，在體評估了D-Bmp2@M對骨折愈合的促進效果、對異位骨化的抑制能力以及初步的生物安全性。
3.1. 理性設計的D-Bmp2保留了生物活性并增強了骨親和力
研究人員通過蛋白質結構預測，將DSS6肽理性融合到Bmp2的N端，以避免影響其生物功能。實驗證實，D-Bmp2在HEK293T細胞中成功表達和分泌，純化后蛋白純度≥98%。圓二色光譜顯示其核心二級結構未受顯著影響。Bmp2報告基因系統、qPCR和Western blot分析均表明，D-Bmp2激活Bmp/Smad信號通路、上調Runx2和Sp7等關鍵成骨轉錄因子表達的能力與Bmp2無顯著差異，證明融合肽未損害其生物活性。更重要的是，羥基磷灰石結合ELISA、組織切片結合實驗及離體股骨結合實驗均一致證明，D-Bmp2對骨組織具有特異且顯著增強的親和力，而對肌肉組織無特殊親和性。
3.2. 自愈合PLGA微球實現了生物活性D-Bmp2的體外持續釋放
通過雙乳化法制備多孔PLGA微球，經被動擴散載藥后，在40°C下加熱2小時誘導微球表面孔隙“愈合”，形成獨特的“密閉獨立腔室”結構。掃描電鏡和共聚焦成像證實了D-Bmp2被成功封裝于微球腔內。該載藥微球可凍干成白色粉末，在4°C下儲存6個月蛋白活性保持穩定。體外釋放實驗顯示，載有Cy7標記D-Bmp2的微球在磷酸鹽緩沖液中能持續釋放約30天，釋放曲線平緩。掃描電鏡動態觀察揭示了微球經歷“表面孔開放—孔網絡擴張—結構降解—最終塌陷”的四階段降解模式，支持其長效釋放能力。對收集的釋放上清進行蛋白濃度和生物活性檢測發現，釋放出的D-Bmp2在整個30天內均保持生物活性，活性下降主要歸因于濃度降低。
3.3. D-Bmp2@M的骨親和力在體外促進成骨并減弱異位成骨分化
通過建立體外Transwell共培養模型進行功能驗證。在成骨細胞-骨模型中，D-Bmp2@M在羥基磷灰石存在的情況下，憑借其緩釋和骨親和雙重特性，顯著增強了MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性、鈣結節礦化以及Runx2和Sp7的基因表達。而在肌肉-骨模型中，D-Bmp2@M能特異性地富集在共培養的牛骨片上，從而顯著降低了下方C2C12肌細胞中堿性磷酸酶活性及Runx2、Sp7的表達，證明了其減少異位成骨分化的潛力。
3.4. D-Bmp2@M在體內實現了具有骨靶向能力的持續釋放
體內熒光成像顯示，游離的Bmp2或D-Bmp2注射后信號快速擴散和清除，而PLGA微球封裝能顯著延長局部滯留時間，其中D-Bmp2@M組的信號維持時間最長（約27天）。注射后第1天和第6天的離體組織熒光成像及組織切片免疫熒光染色均證實，無論是游離形式還是從微球中釋放出來，D-Bmp2相較于Bmp2都在骨組織邊界顯示出更強的特異性富集，骨-肌熒光強度比顯著更高，體現了其優秀的體內骨靶向能力。
3.5. D-Bmp2@M促進骨折愈合并減少體內異位骨化
在小鼠股骨骨折模型中，局部單次注射D-Bmp2@M進行治療。X射線和Micro-CT結果顯示，D-Bmp2@M治療組在術后28天產生了最大、最致密的骨痂，骨折愈合質量最佳。組織學染色（H&E和Masson）進一步證實了該組具有最大的骨痂面積和新骨形成面積。值得注意的是，Bmp2@M治療組在骨痂周圍觀察到了異位骨化（發生率66.7%），而D-Bmp2@M組則未檢測到，顯著降低了這一不良反應。免疫熒光組化顯示，D-Bmp2@M組骨痂中Runx2、Sp7和ALP的表達水平最高，表明Bmp2信號通路被有效激活。
3.6. D-Bmp2@M在體內表現出初步良好的安全性
對接受不同劑量D-Bmp2@M或游離D-Bmp2注射的小鼠進行安全性評價。主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）的組織病理學檢查未發現炎癥、壞死或纖維化等病變。注射部位肌肉和股骨也未觀察到明顯病理改變。血液學分析和血清生化指標（肝功能ALT、AST，腎功能UREA、CREA）均在正常生理范圍內，各組間無顯著差異，表明D-Bmp2@M具有良好的體內安全性。
3.7. D-Bmp2@M促進骨質疏松性骨折愈合
在去卵巢誘導的骨質疏松小鼠骨折模型中，骨折愈合明顯延遲。D-Bmp2@M治療顯著改善了這一狀況，在術后14天即誘導了明顯的骨痂形成。28天時，Micro-CT定量分析顯示，D-Bmp2@M組骨痂的骨密度和骨體積分數顯著高于PBS對照組，并恢復至接近正常骨折小鼠的愈合水平。組織學和免疫熒光組化分析一致表明，D-Bmp2@M治療促進了骨質疏松性骨折的愈合，上調了骨痂中成骨相關標志物的表達，且未引發異位骨化。
研究結論與討論：
本研究成功構建并驗證了D-Bmp2@M這一集成“持續釋放”與“骨靶向遞送”的協同給藥系統。該系統通過理性融合骨親和肽DSS6，使Bmp2獲得了顯著的骨組織靶向能力，且不損害其生物活性；同時，利用獨特的自愈合多孔PLGA微球，實現了D-Bmp2長達約30天的穩定、持續釋放，釋放的蛋白始終保持生物活性。這種時空雙控的設計產生了協同效應：在多種骨折模型，尤其是難愈性的骨質疏松性骨折模型中，D-Bmp2@M單次給藥即可顯著加速骨折愈合，提高骨痂的質量和數量；更重要的是，其骨靶向特性有效限制了Bmp2向周圍軟組織的擴散，從而將Bmp2@M治療組中高達66.7%的異位骨化發生率降低至零。初步的安全性評估顯示該系統具有良好的生物相容性。
該研究的創新之處在于，它沒有局限于單一的遞送策略優化，而是通過巧妙的分子工程和劑型設計，同時攻克了Bmp2臨床應用中的時空兩大瓶頸。相較于釋放周期短（約1周）的傳統載體（如膠原海綿）或缺乏長效作用的單一靶向策略，D-Bmp2@M系統提供了與骨折愈合進程相匹配的長效治療窗口，并通過主動靶向降低了因高劑量使用和脫靶擴散帶來的異位骨化風險。其所用的PLGA材料是FDA已批準的可生物降解材料，DSS6肽是短鏈親水序列，具有較好的臨床轉化潛力。這項工作為治療骨折，特別是伴有愈合障礙的骨質疏松性骨折，提供了一種高效且安全的新策略，展現了顯著的臨床轉化前景。未來的研究可在更大動物模型、長期安全性及免疫原性、以及與臨床金標準載體的直接對比等方面進行深入探索。
