《Bioactive Materials》：A multimodal ROS logic-gated therapeutic platform disrupts the vicious cycle of senescence to promote aged bone defect repair
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本研究針對(duì)老年個(gè)體骨缺損修復(fù)中面臨的衰老微環(huán)境(SME)惡化、氧化應(yīng)激加劇、慢性炎癥和感染等挑戰(zhàn)，開發(fā)了一種多模態(tài)ROS邏輯門控治療平臺(tái)。該平臺(tái)將Mg/Mn摻雜的含氧空位氧化鉍(MMBOx)納米顆粒與負(fù)載雷帕霉素(Rapa)的3D打印水凝膠支架整合，實(shí)現(xiàn)了按需ROS生成抗菌與ROS清除/衰老逆轉(zhuǎn)的雙向調(diào)控。體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可有效清除感染、減輕慢性炎癥、延緩細(xì)胞衰老并促進(jìn)老年大鼠顱骨缺損再生，為改善衰老微環(huán)境、促進(jìn)老年骨再生提供了新策略。
隨著全球人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松和老年性骨折的發(fā)生率顯著上升。然而，老年個(gè)體的骨再生能力嚴(yán)重受損，骨折愈合延遲、骨缺損持續(xù)不愈成為臨床常見難題。這背后的核心障礙是一個(gè)被稱為“衰老微環(huán)境(Senescent Microenvironment, SME)”的惡性循環(huán)：過量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)、慢性炎癥、衰老細(xì)胞的累積以及局部感染相互加劇，共同阻礙了愈合過程。傳統(tǒng)的組織工程策略往往只能單一地應(yīng)對(duì)感染控制或微環(huán)境調(diào)節(jié)，難以同時(shí)破解這個(gè)復(fù)雜的惡性循環(huán)，因此，開發(fā)能夠智能響應(yīng)并雙向調(diào)節(jié)這一動(dòng)態(tài)微環(huán)境的新療法迫在眉睫。
近期，一項(xiàng)發(fā)表在《Bioactive Materials》上的研究為這一難題帶來了突破。該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為“多模態(tài)ROS邏輯門控治療平臺(tái)”的新型生物材料系統(tǒng)。這個(gè)平臺(tái)就像一個(gè)智能的“微環(huán)境修復(fù)師”，能夠根據(jù)骨缺損部位的不同階段（如急性感染期和組織修復(fù)期）切換工作模式，從而有效打斷衰老的惡性循環(huán)，促進(jìn)老年骨缺損的修復(fù)。
為構(gòu)建并驗(yàn)證這一平臺(tái)，研究人員主要應(yīng)用了水熱合成法、3D生物打印技術(shù)、多模態(tài)酶活性評(píng)估、細(xì)胞衰老模型構(gòu)建、RNA測(cè)序分析以及多種動(dòng)物模型（包括大鼠感染性皮膚缺損模型和老年大鼠顱骨缺損模型）。
2. 結(jié)果
2.1. BOx和MMBOx的結(jié)構(gòu)和電子表征
研究人員通過水熱法合成了含氧空位的氧化鉍(Bi2O3with oxygen vacancies, BOx)以及鎂/錳共摻雜的MMBOx納米顆粒。表征顯示，兩者粒徑約50納米，形態(tài)相似。摻雜后，MMBOx的結(jié)晶度略有下降，氧空位濃度從49.53%提升至63.1%。電子順磁共振譜證實(shí)了氧空位的存在，且MMBOx的信號(hào)更強(qiáng)。這些結(jié)構(gòu)變化為后續(xù)的多功能催化性能奠定了基礎(chǔ)。
2.2. BOx和MMBOx的熱性能
紫外-可見光譜顯示，BOx和MMBOx在600-900納米近紅外(NIR)區(qū)有強(qiáng)吸收。在808納米NIR激光照射下，兩者均表現(xiàn)出顯著的光熱升溫效應(yīng)，且MMBOx的光熱性能更優(yōu)、穩(wěn)定性良好。
2.3. BOx和MMBOx的NIR-US協(xié)同增強(qiáng)ROS生成
研究表明，與單獨(dú)NIR或超聲(US)處理相比，US+NIR聯(lián)合處理能協(xié)同顯著增強(qiáng)MMBOx產(chǎn)生羥基自由基(·OH)和超氧陰離子(·O2-)的能力。電子自旋共振分析證實(shí)，MMBOx在US+NIR聯(lián)合作用下具有最強(qiáng)的ROS生成效率。
2.4. 納米顆粒協(xié)同US-NIR增強(qiáng)抗菌活性的機(jī)制
能帶結(jié)構(gòu)分析表明，Mn/Mg摻雜和氧空位使MMBOx的帶隙從2.49 eV減小至2.36 eV。壓電力顯微鏡顯示MMBOx具有更強(qiáng)的壓電性能。電化學(xué)測(cè)試表明MMBOx具有更高的電流密度和更有效的電荷遷移分離。這些特性使得MMBOx在US作用下能作為高效的壓電聲敏劑，而NIR產(chǎn)生的光熱效應(yīng)進(jìn)一步加速了電子-空穴對(duì)的運(yùn)動(dòng)，從而協(xié)同放大了US觸發(fā)的ROS生成，用于高效抗菌。
2.5. 納米顆粒的模擬酶活性
MMBOx展現(xiàn)出pH響應(yīng)的多重模擬酶活性。在酸性(pH=5.5)感染微環(huán)境下，其過氧化物酶(POD)和氧化酶(OXD)樣活性被激活并可通過US/NIR增強(qiáng)，利于產(chǎn)生活性氧殺菌。在生理(pH=7.4)或修復(fù)期微環(huán)境下，其過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)樣活性占主導(dǎo)，可用于清除過量活性氧，恢復(fù)氧化還原穩(wěn)態(tài)。這種pH“門控”的酶活性切換是其實(shí)現(xiàn)邏輯化治療的核心。
2.6. 復(fù)合ROS響應(yīng)性3D可打印水凝膠支架的構(gòu)建
為了將納米顆粒的功能轉(zhuǎn)化為可植入的治療平臺(tái)，研究人員將其整合到一種3D可打印的ROS響應(yīng)性水凝膠支架中。該水凝膠由甲基丙烯酰化明膠-苯硼酸(GelMA-PBA)和聚乙烯醇(PVA)構(gòu)成，形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，兼具良好的可打印性、機(jī)械強(qiáng)度和ROS響應(yīng)降解特性。負(fù)載MMBOx的支架(MMBOx@GPP)顯示出優(yōu)異的過氧化氫(H2O2)清除能力。
2.7. 治療平臺(tái)的體外和體內(nèi)抗菌效果
體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，在模擬感染微環(huán)境(添加H2O2)下，MMBOx@GPP支架在US+NIR聯(lián)合刺激下對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌展現(xiàn)出最強(qiáng)的殺菌和抗生物膜效果。掃描電鏡觀察顯示細(xì)菌膜嚴(yán)重破裂。在大鼠感染性皮膚缺損模型中，植入MMBOx@GPP并施加US+NIR治療，能顯著降低傷口細(xì)菌負(fù)載，并加速傷口愈合，組織學(xué)顯示膠原沉積增加、炎癥減輕。
2.8. 治療平臺(tái)對(duì)衰老BMSCs的ROS調(diào)節(jié)和抗氧化增強(qiáng)作用
在H2O2誘導(dǎo)的衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)模型中，評(píng)估了負(fù)載雷帕霉素的MMBOx/Rapa@GPP平臺(tái)的抗氧化能力。結(jié)果表明，該平臺(tái)能有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧陰離子水平，改善線粒體膜電位。Western blot分析顯示其促進(jìn)了細(xì)胞自噬（LC3-II/LC3-I比率變化，p-mTOR表達(dá)下調(diào)），表明通過清除受損線粒體增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力。
2.9. 治療平臺(tái)使衰老BMSCs rejuvenate并恢復(fù)成骨潛能
該平臺(tái)能顯著下調(diào)衰老BMSCs中p16、p21、p53等衰老標(biāo)志物的表達(dá)，減少衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)陽性細(xì)胞比例，并下調(diào)衰老相關(guān)分泌表型(SASP)相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞周期分析顯示更多細(xì)胞進(jìn)入S期，表明細(xì)胞周期阻滯得到緩解。在成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，MMBOx/Rapa@GPP處理顯著增強(qiáng)了堿性磷酸酶(ALP)活性和鈣結(jié)節(jié)形成，并上調(diào)了成骨相關(guān)基因(Alp, Osx, Runx2, Opn)的表達(dá)。
2.10. RNA-seq分析識(shí)別MMBOx介導(dǎo)BMSCs rejuvenate的潛在通路
RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MMBOx處理的衰老BMSCs中，與細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、端粒維持和抗氧化防御相關(guān)的通路被上調(diào)。特別值得注意的是，谷胱甘肽(GSH)代謝通路被顯著富集。MMBOx通過激活Keap1-Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)了包括谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(Gclc)在內(nèi)的多個(gè)抗氧化基因表達(dá)，從而增加了細(xì)胞內(nèi)總GSH含量和GSH/GSSG比值，增強(qiáng)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激耐受性，延緩了細(xì)胞衰老。
2.11. 治療平臺(tái)通過調(diào)節(jié)衰老微環(huán)境促進(jìn)顱骨缺損再生
在20月齡老年大鼠的顱骨缺損模型中，植入MMBOx/Rapa@GPP支架。術(shù)后7天，局部組織免疫熒光顯示，DNA損傷標(biāo)志物γ-H2A.X、SASP因子(MMP2, IL-6, TNF-α)及細(xì)胞周期抑制蛋白p16、p21表達(dá)下降，而細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)上升，表明局部衰老得到緩解。術(shù)后12周的Micro-CT和 histological 分析顯示，MMBOx/Rapa@GPP組的新生骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和骨密度(BMD)顯著高于對(duì)照組，新生骨中RUNX2和骨鈣素(OCN)表達(dá)增強(qiáng)，表明成骨活性提高。此外，該組還顯示出更佳的血管新生和巨噬細(xì)胞向抗炎M2型極化的趨勢(shì)。
3. 討論 與 4. 結(jié)論
本研究成功構(gòu)建了一個(gè)多模態(tài)ROS邏輯門控治療平臺(tái)，其創(chuàng)新性在于將抗菌、抗氧化、抗衰老功能整合于一個(gè)智能響應(yīng)系統(tǒng)中。平臺(tái)的核心組件MMBOx納米顆粒通過Mg/Mn摻雜和引入氧空位，獲得了增強(qiáng)的壓電、光熱及pH門控的多重模擬酶活性。將其與負(fù)載雷帕霉素的ROS響應(yīng)性3D打印水凝膠結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)骨缺損微環(huán)境的動(dòng)態(tài)、雙向調(diào)控：在感染期酸性環(huán)境下，通過US/NIR激活產(chǎn)生大量ROS高效殺菌；在感染控制后的修復(fù)期，則切換為清除ROS、激活Keap1-Nrf2-GSH抗氧化通路、并協(xié)同雷帕霉素促進(jìn)自噬，從而逆轉(zhuǎn)BMSCs衰老、恢復(fù)其成骨潛能，最終打破衰老微環(huán)境的惡性循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該平臺(tái)能有效控制感染、減輕局部炎癥和衰老、并顯著促進(jìn)老年大鼠的骨缺損再生。這項(xiàng)研究為開發(fā)針對(duì)老年性及感染并發(fā)性骨缺損的“一體化”治療策略提供了新思路和具有轉(zhuǎn)化潛力的平臺(tái)。
