《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Quantitative Analysis of Ternary Complex Kinetics by a Surface Immobilization Method
編輯推薦：
本研究建立了一種整合理論與實驗的方法框架，用于可靠動力學表征靶向蛋白降解中的三元復合物。通過二聚體結合參數指導實驗設計，結合預孵育策略和精確固定化策略，確保測量準確性。應用至CRBN/ARV-825/BRD4系統，發現強正協同效應（α=175），驗證了該框架的有效性，為優化降解劑提供了系統方法。
夏歡梅|楊羅|方若欣|張海娜|米嵐|馬勇|朱向東|丁宇|費一巖
上海超精密光學制造工程研究中心，微納光子結構重點實驗室（教育部），復旦大學未來信息技術學院，中國上海200433
摘要
通過雙功能分子實現目標蛋白降解是一種有前景的治療策略，成功的降解需要高效的三元復合物形成。本研究通過結合理論建模和實驗驗證，建立了一個可靠的三元復合物動力學表征綜合框架。我們證明了二元結合參數可以有效指導實驗設計，而適當的組分固定以及使用校準濃度的預形成二元復合物可以確保測量的準確性。將這種方法應用于CRBN/ARV-825/BRD4系統，發現其具有強烈的正協同性（α = 175），這與卓越的降解效力相關。我們的方法為量化三元復合物動力學提供了一種系統的方法，并為通過動力學指導的設計提供了穩健的平臺。
引言
目標蛋白降解（TPD）是一種新興的治療策略，它利用小分子劫持細胞內的天然降解途徑來誘導蛋白降解。與傳統僅阻斷組分活性的抑制劑不同，TPD可以直接消除目標蛋白（POIs），為治療癌癥、神經退行性疾病和其他病理提供了有希望的方法。[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]
TPD通過多種機制發揮作用，其中雙功能分子是一種有前景的模式。這類分子，如蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs），由兩個通過連接子連接的配體組成，一個配體與POI結合，另一個配體招募E3泛素連接酶，從而促進POI的多泛素化及隨后的蛋白酶體降解。[4]、[5] 同樣，自噬結合化合物（ATTECs）被開發出來，可以同時結合自噬相關蛋白LC3和致病蛋白（如突變型亨廷頓蛋白mHTT），利用溶酶體降解途徑。[6]
雙功能降解劑的一個特征是它們的濃度-響應曲線中的“鉤效應”，即在中間濃度下目標蛋白的降解達到最大值，而在更高劑量下降解效果下降。這種現象的發生是因為過高的降解劑濃度會導致目標蛋白或被招募的效應蛋白飽和，形成非生產性的二元復合物，從而阻礙了降解所需的三元復合物的形成。值得注意的是，“鉤效應”的強度在不同降解劑系統中有所不同。這些濃度依賴性行為直接影響治療窗口和給藥方案，因此理解這些行為對于開發臨床可行的降解劑至關重要。[8]、[9]
最近的研究表明，雙功能降解劑的降解行為受二元和三元平衡解離常數的控制，以及它們之間的比率——協同性因子α =。這里，α > 1表示正協同性，使三元復合物穩定；而α < 1表示負協同性，導致三元復合物不穩定。[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17] 此外，三元復合物的解離速率常數也被證明會影響初始降解速率，從而影響降解劑發揮作用所需的時間。[11] 因此，全面表征平衡和動力學參數對于合理設計降解劑及其作用機制至關重要。
雖然二元結合的表征相對簡單，但確定三元和的方法在技術上仍然具有挑戰性。[13] 一些基于溶液的技術，如時間分辨熒光能量轉移（TR-FRET）、熒光極化（FP）和等溫滴定量熱法（ITC），已被用于測量三元復合物的平衡解離常數。[9]、[10]、[12]、[17] 此外，基于表面的分析方法，包括生物層干涉測量（BLI）和表面等離子體共振（SPR），可以在固定目標蛋白的情況下直接測量動力學速率常數，同時提供平衡常數信息。[10]、[11]、[15]、[17] 然而，由于三元復合物形成的復雜濃度依賴性，以及鉤效應的復雜影響，準確表征和仍然具有挑戰性。因此，僅僅依賴較高濃度往往會導致次優條件，使得系統識別最佳濃度成為一個核心的方法學難題。
為了解決這一挑戰，我們基于易于測量的二元平衡解離常數開發了一個理論和實驗框架，以提供三元復合物形成的最佳條件。該框架建立了值與最大三元復合物產率所需最佳濃度之間的直接關聯，同時也定義了1:1朗繆爾模型適用于三元相互作用的具體條件。我們的結果確定了準確動力學表征的三個關鍵要素：實施預孵育協議、策略性地選擇固定蛋白組分，以及驗證系統是否滿足基本的協同性條件。使用Cereblon（CRBN）/ARV-825/BRD4模型系統和斜入射反射率差異（OI-RD）生物傳感器進行的實驗驗證證實了這些理論推導的原則。
部分摘錄
雙功能降解劑誘導的三元系統中的動力學和平衡參數
圖1展示了一個由雙功能降解劑（分子B）誘導的三元相互作用系統。該系統包括分子A與B之間的二元相互作用，以及分子B與C之間的二元相互作用。形成二元復合物AB的結合速率常數表示為，其解離速率常數表示為。分子A與B之間的相應平衡解離常數定義為。這些動力學和平衡參數遵循相同的命名規則。
三元復合物形成的平衡分析
我們首先研究了在表面固定組分A的測定配置中，組分B和C的濃度以及協同性因子α如何影響三元復合物的平衡濃度。由于基底上可用的結合位點有限，這種配置導致組分A的有效濃度非常低。
圖2(a)顯示了通過數值求解得到的[ABC]/[A]t作為[B]t和[C]t的函數
討論
本研究建立了一個綜合的理論和實驗框架，用于表征目標蛋白降解系統中的三元復合物動力學。我們的分析表明，可以使用二元解離常數預測最佳的三元復合物形成，而預孵育對于維持可靠的動力學測量所需的恒定復合物濃度至關重要。
在CRBN/ARV-825/BRD4模型系統中的實驗驗證顯示了強烈的正協同性
結論
本研究建立了一個綜合的理論和實驗框架，用于分析目標蛋白降解中的三元復合物動力學。我們證明，僅通過二元結合參數就可以指導三元復合物形成的優化。通過適當的實驗設計，包括使用校準濃度的預形成二元復合物和策略性地固定結合能力較弱的組分，可以確保測量的有效性。
CRediT作者貢獻聲明
米嵐：資源提供。馬勇：資源提供。朱向東：軟件、資源提供。丁宇：寫作——審稿與編輯、資源獲取、正式分析、數據管理。夏歡梅：寫作——初稿撰寫、驗證、方法學設計、實驗研究、正式分析、數據管理。楊羅：寫作——初稿撰寫、資源提供、正式分析、數據管理。方若欣：實驗研究、正式分析、數據管理。張海娜：數據管理。費一巖：寫作——審稿與編輯
生成式AI使用聲明
在準備本工作時，作者使用了Deepseek進行語言潤色。使用該工具后，作者根據需要對內容進行了審閱和編輯，并對發表文章的內容負全責。
資金來源
本工作得到了中國國家重點研發計劃（2021YFA0805200）、國家自然科學基金（32271510, 82030106, 62175036, 62175034）、中國國家重點研發計劃（2021YFF0502900）以及上海光操控超表面重點實驗室（23dz2260100）的支持。
