利用可在現場使用的重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification, RCA）和CRISPR/Cas12a切割活性檢測技術，對空氣中的食源性病原體進行現場檢測
《Biosensors and Bioelectronics》：On-site Detection of Airborne Foodborne Pathogens Using a Field-deployable Recombinase Polymerase Amplification and CRISPR/Cas12a Cleavage Activity Assay
編輯推薦：
空氣傳播食源性細菌檢測；重組酶聚合酶擴增（RPA）；CRISPR/Cas12a cleavage activity；快速診斷；便攜式檢測平臺
鄭妍宇|李智娜|崔尚洙|申東民|張秀珍|孫成旭|姜泰俊|鄭珠妍|黃俊浩|林恩京
韓國生物科學與生物技術研究院（KRIBB）生物納米技術研究中心，大田 34141，大韓民國
摘要 隨著全球單人家庭數量的增加，對即食餐盒的需求也在增長，這促使了大規模食品生產系統和復雜供應鏈的發展。然而，在全球變暖的影響下，這些系統容易受到食品污染，尤其是空氣中的食源性細菌的污染。傳統的檢測空氣細菌的方法復雜、耗時且勞動強度高，限制了其在現場應用和快速食品衛生監測中的有效性。在本研究中，我們結合了重組酶聚合酶擴增技術和CRISPR/Cas12a切割活性（RCCVA檢測法），開發了一個可用于現場的診斷平臺，以實現快速、靈敏地識別空氣中的食源性細菌。使用自制的靜電空氣采樣器收集空氣中的細菌，并通過便攜式等溫擴增設備進行分析。RCCVA檢測法能夠檢測四種主要的食源性病原體：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。檢測限分別為274.9、4.5、9.5和28.5個菌落形成單位（CFU）/mL，檢測時間僅需45分鐘。該平臺能夠在大約1小時內實現現場早期檢測，并具有在食品加工環境中進行實時監測的潛力，從而有助于改善公共衛生和食品安全。
引言 隨著全球單人家庭數量的增加，對即食餐盒的需求也在增長（Euromonitor International 2020；美國人口普查局 2023；Eurostat 2025）。這一趨勢推動了大規模食品生產系統的開發和復雜供應鏈的擴展（Badia-Melis等人 2018；James 2023）。然而，在全球變暖的影響下，這些系統更容易受到食品污染和變質的影響。食品中毒是這種污染最著名的后果，每年導致約42萬人死亡（世界衛生組織 2024）。因此，必須在整個生產和分銷過程中系統地管理食品污染，并在食品設施中盡早進行現場檢測。根據美國食品藥品監督管理局（FDA）發布的《Bad Bug Book》，多種細菌菌株會導致食品中毒，其中一些可以通過空氣傳播，被歸類為空氣傳播細菌。例如，金黃色葡萄球菌已在醫院、污水處理設施和畜牧場等受污染環境中被檢測到（Kozajda等人 2019）。腸炎沙門氏菌已知會通過家禽等鳥類造成空氣傳播（Gast等人 1998, 2004）。此外，單核細胞增生李斯特菌對紅肉加工行業構成重大威脅（Dobeic等人 2011），而蠟樣芽孢桿菌被認為是一種易變且具有致病性的細菌（Bottone 2010）。此外，多項研究報道了食源性細菌的空氣傳播和感染案例，揭示了食品鏈中的潛在污染途徑（Oliveira等人 2006；Stein和Chiril? 2017；Yong等人 2024）。因此，有效控制空氣中的細菌對于保護公共衛生至關重要。迄今為止，已經開發了多種現場空氣細菌檢測方法以確�？諝赓|量（Qiu等人 2023；Yong等人 2024）。然而，在大多數情況下，收集的空氣樣本在鑒定和分析之前需要額外的培養步驟。為了克服細菌培養的復雜性和時間消耗，引入了基于蛋白質組和核酸的分析技術（Anaya等人 2007；Chen等人 2023；Qiu等人 2023；Quijano-Rubio等人 2021）。其中，聚合酶鏈反應（PCR）和實時PCR是最廣泛使用的，被認為是金標準的基于核酸的分子診斷技術（Chen等人 2023；Pogner等人 2024；Unterwurzacher等人 2018；Watt等人 2020）。然而，這些技術存在固有的局限性，包括需要熟練的人員、勞動密集型的程序、較長的處理時間以及對配備熒光檢測系統的復雜熱循環儀器的依賴。作為替代方案，包括環介導等溫擴增（LAMP）、滾環擴增（RCA）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、指數擴增反應（EXPAR）和基于核酸序列的擴增（NASBA）在內的等溫擴增方法被廣泛使用（美國食品藥品監督管理局 2020；Gl?kler等人 2021；Huang等人 2018；Li等人 2017；Liu等人 2021；Seo等人 2025；Song等人 2019；Wang等人 2024；Yang等人 2019；Yao等人 2024；Zhao等人 2015；Zheng等人 2025）。例如，LAMP介導的SARS-CoV-2檢測方法于2020年獲得了美國食品藥品監督管理局的批準（美國食品藥品監督管理局 2020）。LAMP已被用于不同應用中的多種病原體檢測。例如，Huang等人使用LAMP檢測了食品樣本中的大腸桿菌O157:H7和腸炎沙門氏菌的毒力基因（Huang等人 2018）�；赗CA的方法已被用于檢測坂崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和金黃色葡萄球菌（Liu等人 2021；Song等人 2019；Yang等人 2019）。RCA擴增產物可以促進DNA酶的形成，如G-四鏈結構，從而產生可檢測的信號（Seo等人 2024；Song等人 2019）。另一種方法RPA也因其簡單性和在等溫條件下的快速擴增能力而被廣泛用于食源性細菌的檢測（Fu等人 2025；Liu等人 2022；Wang等人 2020；Zhang等人 2025）。基于規律間隔短回文重復序列（CRISPR）及其相關蛋白復合體（CRISPR/Cas）的分子診斷系統因可編程性和高目標特異性而受到廣泛關注（Ki等人 2023；Li等人 2023；Song等人 2023；Yang等人 2023）。為了增強信號傳導，CRISPR/Cas系統通常與其他目標擴增方法結合使用�；谶@一策略，He等人將RCA與CRISPR/Cas12a系統結合，開發了一種用于從細胞外囊泡中敏感檢測miRNA的一鍋法檢測方法（Yan等人 2023）。同樣，Chen等人將RCA與CRISPR/Cas12a結合，通過電化學信號檢測大腸桿菌O157:H7（Chen等人 2021）。Liu等人還報告了使用RPA與CRISPR/Cas12a檢測食品基質中的沙門氏菌（Liu等人 2022）。Zhang等人結合RPA和CRISPR/Cas系統開發了一種雙模式檢測結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的平臺（Zhang等人 2025）。熒光探針被金納米顆粒（AuNPs）淬滅，當識別到目標時，CRISPR/Cas系統會從AuNPs中釋放熒光探針，恢復熒光。同樣，Arshad等人使用RPA/CRISPR-Cas12a系統和CeO2納米酶作為信號報告劑來檢測沙門氏菌（Arshad等人 2024）。盡管取得了顯著進展，但RPA-CRISPR/Cas系統在空氣細菌現場檢測中的應用仍需進一步探索。因此，我們使用RPA-CRISPR/Cas系統來檢測空氣中的食源性細菌。使用自制的靜電空氣采樣器收集空氣中的細菌，隨后通過便攜式等溫擴增設備進行分析。設計了基于RPA/CRISPR的試劑，專門用于檢測四種主要的食源性病原體：金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌。收集空氣中的細菌后，使用重組酶聚合酶擴增（RPA）-CRISPR/Cas12a切割活性（RCCVA檢測法）進行快速現場分析（圖1）。
RPA引物和crRNA在RCCVA檢測中的性能評估 對于RCCVA檢測，首先設計了針對食源性病原體相關細菌毒力基因的RPA引物，包括金黃色葡萄球菌的LukE、腸炎沙門氏菌的invA和pipD、蠟樣芽孢桿菌的EntFM以及單核細胞增生李斯特菌的actA和plcB。RPA引物及其結合位點分別如圖2a–5a所示。相應的RPA引物序列列于表S1中。為了驗證每個RPA引物組的特異性反應性，從每種
結論 在本研究中，我們成功開發了一個可用于現場檢測空氣中的食源性細菌的監測平臺。使用自制的靜電空氣采樣器收集空氣中的細菌，隨后結合便攜式等溫擴增設備和RCCVA DNA檢測系統進行分析。該平臺消除了耗時的程序和對復雜PCR儀器的需求，同時提高了靈敏度和特異性。
材料 PBS（片劑）購自Sigma-Aldrich（美國密蘇里州圣路易斯）。QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒購自Qiagen（德國希倫）。TwistAmp? Liquid Basic試劑盒購自TwistDx（美國馬薩諸塞州劍橋）。DEPC處理的水購自SolBio（韓國水原），10× TBE緩沖液購自Biosesang（韓國京畿道華城市）。dNTPs（10 mM，每種2.5 mM）、DNA寡核苷酸和AccuPrep?基因組DNA提取試劑盒購自Bioneer
CRediT作者貢獻聲明 張秀珍： 資源、方法學。
申東民： 方法學、調查。
姜泰俊： 資金獲取。
孫成旭： 驗證、資源。
黃俊浩： 寫作——審稿與編輯、寫作——初稿、資金獲取。
鄭珠妍： 資源、資金獲取。
林恩京： 寫作——審稿與編輯、寫作——初稿、項目管理、概念化。
鄭妍宇： 寫作——初稿、數據管理、概念化。
崔尚洙： 方法學
利益沖突聲明 ? 作者聲明他們沒有可能影響本文工作的已知財務利益或個人關系。
致謝 本研究的數據可在韓國生物數據站（K-BDS，
http://kbds.re.kr ）的訪問號KAP241790下獲取。本研究得到了韓國國家研究基金會（NRF）和韓國國家科學技術委員會（NST）的支持，資金來自韓國政府（MSIT）（2023R1A2C2005185、RS-2024-00348576、RS-2024-00459749、RS-2025-00554718、2020R1A5A1018052和GTL25061-000）；以及韓國工業技術評價研究所（KEIT）的支持
