通過磁珠限制的催化發(fā)夾結(jié)構(gòu)實現(xiàn)超靈敏的miRNA檢測，該結(jié)構(gòu)能夠促進轉(zhuǎn)錄驅(qū)動的crRNA組裝以及CRISPR/Cas12a的激活
《Biosensors and Bioelectronics》：Ultrasensitive miRNA detection via magnetic bead-confined catalytic hairpin assembly enabling transcription-driven crRNA assembly and CRISPR/Cas12a activation
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CRISPR/Cas12a結(jié)合催化發(fā)夾組裝（CHA）通過磁珠受限平臺實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄驅(qū)動crRNA重裝與Cas12a激活，顯著提升miRNA檢測靈敏度至65.3 aM，并成功應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞系和血清樣本檢測，同時整合側(cè)流層析法增強臨床實用性。
潘明曦 | 呂夢梅 | 倪銀剛 | 蘇梅 | 趙成軍 | 梅如宇 | 英展明
教育部環(huán)境友好化學(xué)與應(yīng)用重點實驗室；湖南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院綠色有機合成與應(yīng)用重點實驗室，湘潭，411105，中國
摘要
CRISPR/Cas12a與催化發(fā)夾組裝（CHA）的結(jié)合是一種主要依靠CHA生成dsDNA激活劑以直接激活Cas12a的策略，已成為分子診斷中的強大工具。然而，仍存在兩個主要挑戰(zhàn)：dsDNA對嚴(yán)格原間隔序列（PAM）的依賴性以及發(fā)夾雜交產(chǎn)生的背景信號泄漏。在此，我們報道了一種基于磁珠的平臺，該平臺通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)crRNA的重組和Cas12a的激活，從而實現(xiàn)超靈敏的miRNA檢測。目標(biāo)分子觸發(fā)的CHA組裝從三個最初鎖定的發(fā)夾（H1、H2和H3）動態(tài)構(gòu)建了一個T7轉(zhuǎn)錄模板，該模板不僅轉(zhuǎn)錄出支架RNA，還與其自身產(chǎn)物雜交形成DNA/RNA復(fù)合物，從而激活Cas12a。將分裂的T7啟動子與CHA結(jié)合有效地抑制了背景信號，提高了檢測靈敏度。此外，磁珠增加了局部濃度和反應(yīng)動力學(xué)，共同顯著提升了檢測靈敏度。此外，專為轉(zhuǎn)錄驅(qū)動的Cas12a設(shè)計的crRNA組裝策略不僅規(guī)避了傳統(tǒng)的PAM依賴性dsDNA激活途徑，還實現(xiàn)了無需額外激活劑的自我供應(yīng)crRNA。我們證明了該生物傳感器對miRNA-21的檢測具有出色的靈敏度，達到了65.3 aM的檢測限。此外，通過準(zhǔn)確量化細(xì)胞系和人血清中的目標(biāo)水平，初步驗證了該方法的實用性。我們的方法提供了一種具有變革潛力的可行解決方案，旨在應(yīng)對當(dāng)代診斷應(yīng)用中的復(fù)雜挑戰(zhàn)。
引言
微小RNA（miRNA）是作為基因表達關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的小型非編碼RNA（Gebert和MacRae，2019）。異常的miRNA表達水平與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，使得miRNA成為疾病診斷的非常有前景的生物標(biāo)志物（Winkle等人，2021）。然而，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法，如微陣列（Schaudy等人，2022）、Northern印跡（Choi等人，2017）和定量逆轉(zhuǎn)錄實時聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）（Jet等人，2021），通常受到復(fù)雜儀器、訓(xùn)練有素的操作人員和繁瑣操作程序的限制。最近，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）和CRISPR相關(guān)（Cas）蛋白受到了廣泛關(guān)注，并發(fā)展成為多個領(lǐng)域的開創(chuàng)性生物技術(shù)工具，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控（McCarty等人，2020；Qin等人，2025；Yang等人，2022）和分子診斷（Green等人，2022；Hu等人，2025）。特別是CRISPR/Cas12a系統(tǒng)由于其高效的轉(zhuǎn)錄切割活性而成為miRNA檢測的主流平臺，該活性在特定目標(biāo)分子激活下無差別地降解周圍的單鏈DNA（ssDNA）（Chen等人，2018；Xiao等人，2025；Zhao等人，2024）。然而，未經(jīng)預(yù)擴增步驟的情況下，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對miRNA的檢測靈敏度嚴(yán)重受限，僅達到皮摩爾（pM）水平（Huyke等人，2022；Ramachandran和Santiago，2021），這阻礙了基于Cas12a的生物傳感器發(fā)展成為通用檢測平臺的發(fā)展。
為了解決這些限制，研究方向集中在通過工程化crRNA和引入等溫擴增來提高CRISPR/Cas12a的性能。一方面，多項研究探索了通過各種方法修改crRNA以調(diào)節(jié)Cas12a的活性，包括延長crRNA長度（Liu等人，2025b）、光控技術(shù)（Li等人，2024）和分裂crRNA（Zeng等人，2025）。然而，這些策略的實際應(yīng)用往往受到技術(shù)和經(jīng)濟挑戰(zhàn)的阻礙。復(fù)雜的crRNA結(jié)構(gòu)不僅成本高昂，還可能對Cas12a的轉(zhuǎn)錄切割活性產(chǎn)生不利影響。另一方面，當(dāng)結(jié)合等溫擴增時，Cas12a的靈敏度顯著提高，等溫擴增包括酶介導(dǎo)和非酶介導(dǎo)的方法。酶介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)，如重組酶聚合酶擴增（RPA）（Liu等人，2025a）和環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（LAMP）（Pan等人，2025），通過擴增特定目標(biāo)序列顯著提高檢測靈敏度。最近，體外轉(zhuǎn)錄擴增作為一種強大策略出現(xiàn)，這得益于可編程轉(zhuǎn)錄開關(guān)的發(fā)展，允許在體外精確和動態(tài)地控制RNA輸出（Gupta和Krieg，2024；Lee等人，2024；Xiong等人，2024；Yoon等人，2022）。Wang等人開發(fā)了一種基于CRISPR的方法，利用轉(zhuǎn)錄擴增自我供應(yīng)crRNA以激活Cas12a，并實現(xiàn)了miRNA檢測（Wang等人，2020）。然而，該系統(tǒng)未能將轉(zhuǎn)錄和Cas12a激活集成到一步中，這使得操作流程復(fù)雜化并延長了總檢測時間。作為回應(yīng)，非酶方法如CHA和HCR引起了廣泛關(guān)注，作為穩(wěn)健的替代方案（Jia等人，2022；Peng等人，2020），主要通過擴增激活劑與crRNA的結(jié)合來激活Cas12a。然而，非酶電路從根本上受到核酸探針隨機擴散的限制，經(jīng)常導(dǎo)致反應(yīng)動力學(xué)緩慢和背景信號升高（Liu等人，2019；Xu等人，2022；Zhao等人，2025）。為了緩解這一問題，研究人員采用了復(fù)雜的空間限制和目標(biāo)富集策略（Bao等人，2025；Ma等人，2025；Qing等人，2020）。例如，Sui等人使用的球形DNA納米結(jié)構(gòu)創(chuàng)建了一個高濃度的納米級反應(yīng)環(huán)境，顯著提高了局部碰撞頻率和反應(yīng)效率，產(chǎn)生了用于Cas12a的特異性dsDNA激活劑（Sui等人，2025）。然而，這些先進配置通常需要外源性引入Cas12a激活劑，從而增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性并可能影響實用性。因此，基于Cas12a策略的快速動力學(xué)和實驗簡便方法的發(fā)展仍然是一個重大挑戰(zhàn)。
在此，我們構(gòu)建了一種新型生物傳感器，稱為磁珠限制的CHA介導(dǎo)的模板激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)（MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)），用于miRNA的檢測。目標(biāo)miRNA觸發(fā)CHA電路自組裝成一個完整的T7轉(zhuǎn)錄模板，該模板被轉(zhuǎn)錄成支架RNA，與模板的粘性末端雜交形成功能性crRNA，最終激活Cas12a的轉(zhuǎn)錄切割活性。該設(shè)計將分裂的T7啟動子與基于磁珠的CHA結(jié)合，有效抑制非特異性轉(zhuǎn)錄，最小化背景噪聲，同時對低豐度miRNA實現(xiàn)高靈敏度。轉(zhuǎn)錄模板組裝策略不僅介導(dǎo)支架RNA的轉(zhuǎn)錄，還作為Cas12a的激活劑，從而簡化了實驗程序。該策略成功應(yīng)用于miRNA的檢測，并用于準(zhǔn)確分析不同腫瘤細(xì)胞系和人血清樣本中的miRNA-21水平。此外，將這種方法與側(cè)向流式檢測（LFA）結(jié)合，展示了其在臨床診斷中的潛在應(yīng)用。
材料與試劑
所用材料和試劑的描述見支持信息。所有寡核苷酸序列列于表S1和S2中。
CHA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄模板
首先，將單鏈發(fā)夾H1、H2和H3稀釋并在95°C下熱退火5分鐘，然后逐漸冷卻（1°C/分鐘）以促進發(fā)夾形成。隨后加入1 μL H1、H2、H3（每種10 μM）、不同濃度的1 μL miRNA-21、14 μL DEPC處理的水和2 μL NEB2.1緩沖液（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM...）
MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的工作原理
鑒于miRNA-21在多種癌癥中異常過表達的臨床相關(guān)性（Yan等人，2023），所提出的MB-CHA@TA-CRISPR/Cas12a檢測方法利用CHA生成的轉(zhuǎn)錄模板來激活Cas12a進行檢測。工作原理如圖1所示。在這個設(shè)計中，整個反應(yīng)過程可以分為兩個功能模塊。第一個模塊在目標(biāo)識別后觸發(fā)CHA激活，組裝一個完整的T7啟動子轉(zhuǎn)錄...
結(jié)論
總結(jié)來說，我們建立了一種基于磁珠富集CHA的生物傳感器，用于介導(dǎo)Cas12a的模板激活，從而實現(xiàn)miRNA的高靈敏度檢測。這種級聯(lián)擴增過程由CHA啟動，隨后通過轉(zhuǎn)錄進行，再通過磁珠濃縮反應(yīng)組分，實現(xiàn)了檢測靈敏度的協(xié)同增強。CHA介導(dǎo)的完整T7啟動子的形成有效防止了非特異性轉(zhuǎn)錄...
CRediT作者貢獻聲明
潘明曦：數(shù)據(jù)整理、方法學(xué)、撰寫——原始草稿。呂夢梅：資源獲取、監(jiān)督、驗證。倪銀剛：項目管理、軟件。蘇梅：正式分析、研究。趙成軍：研究、驗證。梅如宇：研究。英展明：概念化、資金獲取、資源管理、監(jiān)督、撰寫——審稿與編輯。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務(wù)利益或個人關(guān)系可能影響本文所述的工作。
致謝
本工作得到了國家自然科學(xué)基金（21974041）、湘潭大學(xué)研究經(jīng)費（21QDZ08）、湖南省自然科學(xué)基金（2023JJ30579）和湖南省衛(wèi)生健康委員會科技項目（20255620）的支持。
