精確操縱基因組信息的能力已經(jīng)徹底改變了現(xiàn)代生物學(xué)，在生物醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了重大進(jìn)展。在過去的十年中，可編程核酸酶，尤其是CRISPR-Cas（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及CRISPR相關(guān)蛋白）系統(tǒng)，將基因組編輯從一項(xiàng)技術(shù)要求高、通量低的努力轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋�通用且廣泛可及的平臺技術(shù)。這個領(lǐng)域的一個核心前沿是多重基因組編輯（MGE），其目標(biāo)是在單個細(xì)胞內(nèi)同時引入對多個基因組位點(diǎn)的修飾。MGE正成為剖析多基因性狀、重建多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、設(shè)計復(fù)雜代謝途徑以及生成復(fù)雜疾病模型的必要工具。通過協(xié)調(diào)的遺傳擾動，多重編輯方法相較于單一位點(diǎn)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜生物系統(tǒng)更細(xì)致、更組合式的調(diào)控，并且能更近似地模擬性狀和/或生化通路如何被自然發(fā)生的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。

然而，基于SpCas9的多重編輯廣泛應(yīng)用受到若干內(nèi)在限制，包括嚴(yán)格的原間隔序列臨近基序（PAM）要求、對DNA雙鏈斷裂（DSBs）的依賴，以及對通常效率低下或易出錯的內(nèi)源性DNA修復(fù)途徑的依賴。這些限制對需要高精度、可預(yù)測結(jié)果或在許多位點(diǎn)進(jìn)行廣泛組合編輯的應(yīng)用構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。

為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)并擴(kuò)展MGE的功能范圍，超越SpCas9的多樣化下一代基因組編輯技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)。這些方法將工程化的可編程靶向核酸酶或切口酶與一系列生化效應(yīng)器配對，以提高編輯精度，擴(kuò)大靶向靈活性，并且關(guān)鍵地實(shí)現(xiàn)不引入DSB的多重遺傳修飾。支持這一發(fā)展的主要創(chuàng)新包括堿基編輯（BE）和先導(dǎo)編輯（PE）。同時，整合酶連接系統(tǒng)和基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的平臺可以促進(jìn)無痕DNA整合、大規(guī)�；�因組重寫和連續(xù)的體內(nèi)多樣化。總的來說，這些進(jìn)展已將MGE從單一位點(diǎn)編輯的直接擴(kuò)展，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋�用于在廣泛生物體中精確安裝確定基因組編輯的模塊化且通用的工具包。

多重堿基編輯（MBE）能夠在不誘導(dǎo)DSB的情況下，在多個基因組位點(diǎn)同時引入精確的核苷酸替換，這對于需要可預(yù)測編輯結(jié)果和減少基因毒性的應(yīng)用尤其有吸引力。通過共同遞送一個堿基編輯器與多個gRNA，MBE已成功應(yīng)用于多種生物系統(tǒng)。

在哺乳動物系統(tǒng)中，許多治療開發(fā)的高優(yōu)先級領(lǐng)域，例如工程化同種異體嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞，得益于MBE提供的高精度和高效率。在微生物和真菌系統(tǒng)中，MBE已成為合成生物學(xué)和代謝工程的有效工具。例如，在枯草芽孢桿菌中，對核糖體結(jié)合位點(diǎn)的MBE已被用于定量調(diào)控整個代謝途徑的基因表達(dá)，重定向碳通量，并顯著提高番茄紅素產(chǎn)量而不破壞編碼序列。類似地，在絲狀真菌中，MBE促進(jìn)了調(diào)控元件的組合擾動，支持系統(tǒng)地激活隱蔽的生物合成基因簇，并加速了天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。

額外的多重控制層次已通過使用正交RNA支架和其他適體-蛋白質(zhì)相互作用模塊實(shí)現(xiàn)，使得能夠同時部署不同的BE活性或?qū)�BE與其他基因組擾動模式整合。通過持續(xù)整合蛋白質(zhì)工程、RNA結(jié)構(gòu)設(shè)計和基因表達(dá)控制，MBE正在穩(wěn)步擴(kuò)展跨多種生物系統(tǒng)的精確基因組工程設(shè)計空間。

先導(dǎo)編輯提供了額外的靈活性，以整合堿基編輯不易實(shí)現(xiàn)的小的、期望的編輯，使其成為探究特定遺傳變異功能的有力工具。最近的工作表明，穩(wěn)定表達(dá)PE機(jī)制并結(jié)合大型先導(dǎo)編輯引導(dǎo)RNA（pegRNA）庫的工程細(xì)胞，可用于高通量篩選變異效應(yīng)。這些篩查策略擴(kuò)展到更多基因和功能表征不良的基因組區(qū)域，預(yù)計將產(chǎn)生關(guān)于基因調(diào)控和疾病分子機(jī)制的新見解。

除了篩查應(yīng)用，多重先導(dǎo)編輯（MPE）在作物精確基因組工程中的應(yīng)用日益增加。在水稻中，模塊化pegRNA組裝策略使得能夠同時先導(dǎo)編輯多個農(nóng)藝重要性基因，而替代性PE系統(tǒng)簡化了pegRNA設(shè)計并提高了多個位點(diǎn)的編輯效率。同樣，在六倍體小麥中也展示了高效的MPE，突顯了即使是在高度復(fù)雜的多倍體基因組中進(jìn)行不依賴DSB的多重精確編輯的可行性。

與MBE類似，MPE的許多實(shí)際和治療應(yīng)用需要經(jīng)過編輯的細(xì)胞在一次擾動中獲得均勻的編輯組合，而不是通過隨機(jī)遞送來自混合庫的單個gRNA。為此，最近的研究使用大容量遞送系統(tǒng)，例如桿狀病毒衍生載體，將PE機(jī)制與多個pegRNA一起包裝在確定的啟動子下，在人類細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)高效的MPE。展望未來，進(jìn)一步擴(kuò)展MPE系統(tǒng)，包括使用更長的gRNA陣列或額外的輔助基因組擾動效應(yīng)器，將需要對PE蛋白和pegRNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行協(xié)同工程化，以確保在多種細(xì)胞環(huán)境中具有魯棒的性能。

在機(jī)制上與PE不同但概念相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的MGE，為不依賴DSB的精確編輯提供了另一種途徑。通過將逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的單鏈DNA供體整合與基于CRISPR的靶向相結(jié)合，這種方法能夠同時引入多種編輯，包括替換、插入和缺失，并支持連續(xù)的體內(nèi)多樣化。因此，基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)為細(xì)菌系統(tǒng)中的快速進(jìn)化工程提供了一個有前景的平臺。盡管目前的實(shí)現(xiàn)主要在細(xì)菌系統(tǒng)中，基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的平臺突顯了超越經(jīng)典Cas9基PE方法的多重精確編輯的擴(kuò)展設(shè)計空間。

除了由堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器實(shí)現(xiàn)的核苷酸級精確編輯外，一類不斷擴(kuò)展的基因組工程技術(shù)通過可編程DNA重組和整合，在不依賴CRISPR系統(tǒng)的情況下實(shí)現(xiàn)多重“基因組重寫”。這些酶系統(tǒng)通過在更高層次的基因組組織上運(yùn)作，催化大規(guī)模的靶向插入、缺失、倒位或盒式交換。重要的是，它們的正交性和模塊化使這些系統(tǒng)特別適合于跨不同生物體的可擴(kuò)展多重基因組操作。

位點(diǎn)特異性重組酶，如Cre、Flp和φC31，長期以來一直被用作條件性基因組操作的工具。然而，早期應(yīng)用受到正交靶點(diǎn)缺乏和重組事件間交叉反應(yīng)性的限制。定向進(jìn)化和理性蛋白質(zhì)工程學(xué)的進(jìn)展已大大擴(kuò)展了這個工具包。重組酶系統(tǒng)也被用于可編程控制基因組結(jié)構(gòu)而非靜態(tài)序列修飾。最近開發(fā)的真核多重位點(diǎn)特異性倒位系統(tǒng)能夠同時且可逆地倒位多個基因組片段，為重新連接調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)提供了一種動態(tài)手段。應(yīng)用于代謝工程，這種方法允許通過切換基因方向和調(diào)控背景來組合探索通路配置，而無需引入永久性DNA損傷。

連接CRISPR介導(dǎo)的靶向與重組酶化學(xué)，RNA引導(dǎo)的整合酶代表了另一類能夠進(jìn)行多重基因組重寫的酶。CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶和整合酶系統(tǒng)將RNA引導(dǎo)的DNA識別與大片段DNA的位點(diǎn)特異性整合相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)高效MGE而無需形成DSB。這些系統(tǒng)在細(xì)菌中的演示顯示，能夠在確定的基因組位置同時高效插入多個遺傳元件，建立了一條可編程的、大規(guī)�；�因組重寫的途徑，該途徑與CRISPR-Cas9介導(dǎo)的編輯正交。雖然這些系統(tǒng)目前在原核背景下特征描述最為清楚，但RNA引導(dǎo)的整合酶為未來的真核基因組工程平臺提供了一個引人注目的藍(lán)圖。與BE或PE相比，這些系統(tǒng)不太適合細(xì)微的序列改變，但在可預(yù)測、正交且可擴(kuò)展地操縱大片段基因組元件方面表現(xiàn)出色。隨著工程策略繼續(xù)提高這些效應(yīng)器的特異性、正交性和誘導(dǎo)性，基因組重寫技術(shù)可能在合成染色體設(shè)計、代謝通路優(yōu)化和長期細(xì)胞記憶編碼等應(yīng)用中發(fā)揮越來越核心的作用。

得益于過去十年中的重要發(fā)展，精確MGE技術(shù)現(xiàn)已確立為跨多樣生物系統(tǒng)進(jìn)行協(xié)調(diào)多基因修飾的可靠且靈活的方法。在哺乳動物、植物、真菌和細(xì)菌中的概念驗(yàn)證研究共同證明，MGE能夠?qū)崿F(xiàn)可預(yù)測的編輯結(jié)果，同時克服與傳統(tǒng)CRISPR策略相關(guān)的許多局限。盡管取得了這些進(jìn)展，但重大挑戰(zhàn)仍然限制了其在生物體、組織和應(yīng)用領(lǐng)域的更廣泛采用。即使MGE機(jī)制在已充分表征的位點(diǎn)上表現(xiàn)高效，擴(kuò)展到新的基因組位點(diǎn)也需要從大的組合設(shè)計空間中進(jìn)行系統(tǒng)性設(shè)計和優(yōu)化的gRNA的經(jīng)驗(yàn)性評估。繼續(xù)開發(fā)高通量引導(dǎo)RNA優(yōu)化方法，以及改進(jìn)計算工具以最小化引導(dǎo)干擾和競爭，對于促進(jìn)MGE在治療和農(nóng)業(yè)背景下的更廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。

與此同時，將MGE機(jī)制高效遞送到目標(biāo)細(xì)胞和組織仍然是廣泛采用的主要障礙，特別是在具有復(fù)雜多倍體基因組以及妨礙遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的植物系統(tǒng)中。MGE可用于擾動的細(xì)胞行為的概念范圍也正在發(fā)生顯著變化。早期的努力主要集中在組合基因敲除或致病性變異糾正，而堿基編輯和先導(dǎo)編輯的最新進(jìn)展突顯了MGE在實(shí)現(xiàn)多重和定量基因表達(dá)調(diào)控方面的潛力。靶向調(diào)控元件、非翻譯區(qū)、表觀遺傳調(diào)控因子和翻譯控制序列，能夠?qū)�基因表達(dá)、代謝通量和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)行為進(jìn)行分級和可預(yù)測的微調(diào)。這種策略對于代謝工程、天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)和作物改良特別有效，在這些領(lǐng)域，跨多個位點(diǎn)的細(xì)微且協(xié)調(diào)的擾動通常優(yōu)于依賴簡單激活或失活的二元遺傳干預(yù)。

最后，MGE現(xiàn)在涵蓋了不斷擴(kuò)展且日益多樣化的可編程基因組效應(yīng)器庫。雖然經(jīng)過廣泛工程化的平臺如Cas9繼續(xù)為基因組操作提供基礎(chǔ)，但較新的效應(yīng)器和非CRISPR系統(tǒng)，特別是基于重組酶和整合酶的技術(shù)，正通過提高正交性、減少PAM要求以及支持更大或更復(fù)雜的基因組修飾來拓寬多重編輯的范圍。這些效應(yīng)器的持續(xù)多樣化和優(yōu)化將提供更大的靈活性，包括引入編輯的規(guī)模和內(nèi)容，以及它們對基因調(diào)控的影響，從而實(shí)現(xiàn)更精確的基因組工程策略并產(chǎn)生更復(fù)雜的遺傳功能模型。

總之，這些匯聚的進(jìn)展將MGE定位為探究和操縱生物復(fù)雜性的核心技術(shù)。蛋白質(zhì)工程、基因組生物學(xué)、遞送科學(xué)和計算生物設(shè)計領(lǐng)域的持續(xù)進(jìn)展正在迅速擴(kuò)展精確MGE的能力。隨著這些領(lǐng)域的日益交叉，預(yù)計MGE將在未來幾年推動生物醫(yī)學(xué)研究、農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)的重大創(chuàng)新。