《Environmental Research》：Mechanism of pyrene remediation in soil by biochar-immobilized laccase
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研究采用酸激活的小麥秸稈生物炭固定漆酶，有效降解土壤中苯并[a]芘。實驗表明固定化酶在pH3-7、20-60℃下活性保留超50%，50天降解率達80.33%，且微生物酶活性提升顯著（100.5%-107.1%）。通過分析不同熱解溫度生物炭的理化特性及微生物群落變化，揭示了酶固定化與生物炭協同作用機制，證實該技術兼具環境友好性和高效性。
Babar Hussain|Sami Ullah|Nadeem Iqbal|You Wu|Hui Ma|Chenglong Yu|Shiyong Sun|Shengyan Pu
中國四川省成都市雙流區順星路附近的一個蔬菜種植區采集了土壤樣本。土壤樣本的采集深度為0-20厘米。
地球災害預防與地質環境保護國家重點實驗室（成都理工大學），中國四川省成都市610059
摘要
芘通過多種途徑進入土壤，會滲透到食物鏈中，導致人類的突變和致癌疾病。雖然已經有多種化學和物理方法可以有效去除土壤中的芘，但這些方法存在一些缺點，包括成本高、耗時、勞動強度大以及會產生二次污染物。因此，本研究采用了一種環保且可持續的化學方法，即利用酶的固定化技術。通過熱解、酸活化制備小麥秸稈生物炭，并利用交聯吸附技術將漆酶固定在生物炭上。實驗結果顯示，在pH 3–7、溫度20–60°C的條件下，固定化的酶活性保持了50%以上；經過五次循環和50天的儲存后，其相對活性仍保持在50%以上。經過50天的處理后，芘的去除率達到了80.33%，二次回歸模型表明去除效率會隨時間進一步提高，最終可達到53.56%。與對照組相比，土壤中的酚過氧化物酶、過氧化物酶和脫氫酶活性分別增加了105.2-107.1%、155.1-167.2%和104.8-157%。在固定化酶處理中，Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria是主要的菌門，而Bacillus、Lysinibacillus、Sedimentibacter、Brevundimonas、Christensenellaceae_R-7_group、Sphingobium和Stenotrophomonas是最豐富的屬。這些微生物參與了土壤中芘和其他有機污染物的降解過程。因此，可以得出結論：將漆酶固定在小麥秸稈生物炭上是一種綠色且可持續的土壤芘修復方法，適用于農業和工業應用。
引言
多環芳烴（PAHs）是復雜的有毒污染物，它們通過自然過程（火山、森林火災、礦山）和人類活動（有機物質燃燒、熱解、工業生產、車輛排放）進入土壤（Dai等人，2022年；J. Wang等人，2023年）。據報道，廣州農業土壤中的PAHs濃度為59.6 μg kg–1 ?PAH（Chen等人，2023年），天津大甘油田的PAHs濃度為4400 μg kg–1 ?PAH（J. Liu等人，2023年）。此外，中國每年排放的PAHs總量為32,720噸，占全球總量的21%（Han等人，2019年）。PAHs通過吸收、吸入和皮膚接觸在人體內積累（Wang等人，2012年）。在PAHs中，芘是最持久、最具致癌性、分子量最大的化合物，且難以分解。國際癌癥研究機構將其歸類為2A組，美國環保署（USEPA）也將其列為最致命的化學物質之一（Hussain等人，2025年；Wang等人，2024年，2021年）。因此，迫切需要開發高效且先進的技術來修復芘，同時不會對土壤造成破壞。
目前，已經使用了物理、化學和生物方法來修復土壤和水中的PAHs，但這些方法在效率、可行性、成本和產生二次污染物方面存在局限性（Ranc等人，2017年；Sakshi等人，2019年）。物理方法如土壤清理、等離子體修復、挖掘、玻璃化、電動力學處理和熱脫附需要大量的能量、成本和時間（Han等人，2021年）。化學修復方法涉及使用過氧化氫、過硫酸鹽、氧化鐵和高錳酸鹽等化學物質，通過芬頓反應氧化PAHs（Sakshi等人，2019年）。盡管這些方法相比傳統方法具有多種優勢，但也可能產生二次污染物、非目標反應、破壞微生物活性和改變土壤生態系統平衡（Qi等人，2025年；Ullah等人，2025年；Wang等人，2025年）。
近年來，生物修復技術因其高效的催化降解能力、節能效果、低程度的生物化學毒素釋放以及潛在的生物吸附劑恢復和回收能力而受到關注（Du等人，2024年；L. Wang等人，2023年）。因此，它成為修復受PAHs污染土壤的有前景的技術。在這方面，微生物（如細菌和白腐真菌）可以通過向污染環境中釋放外源微生物和胞外酶來修復PAHs污染物（Du等人，2024年；L. Wang等人，2023年）。研究表明，漆酶在降解各種環境污染物方面表現出優異的生物催化效率（Al-sareji等人，2025年）。作為一種木質素分解的白腐真菌，漆酶含有四種銅離子和氧化還原活性，能夠有效分解多種PAHs（Hussain等人，2024年）。然而，漆酶的穩定性、可回收性和環境敏感性限制了其實際應用。另一個問題是，許多受污染的土壤呈堿性，這限制了酶在生態修復中的使用，因為酶在酸性條件下才能良好發揮作用（Al-sareji等人，2025年；L. Wang等人，2023年；Zhu等人，2007年）。總之，使用游離酶的主要缺點是其在儲存過程中的穩定性較低，以及土壤條件（pH值和溫度）可能導致酶失活和破壞。酶的固定化技術顯著解決了這些問題，不僅提高了酶在污染環境中的存活率和保留率，還提高了降解效率，并在溫和的環境條件下增強了催化性能（Al-sareji等人，2025年；Sun等人，2025年）。目前，固定化酶比游離酶更具優勢，因為它們的活性持續時間更長，且減少了純化的需要。通過化學或生物方法將酶附著在載體或支撐材料上，可以提高酶的催化性能，使其在惡劣環境條件下更具適應性。然而，不同的載體或支撐材料可能需要復雜的合成步驟，機械強度較低，或者可能產生二次污染物（Du等人，2024年；Sun等人，2025年）。因此，需要進一步研究更便宜、易于制備、易于獲取且環保的載體或支撐材料。
研究表明，游離漆酶在極端堿性環境中的活性會降低，而固定化的漆酶在儲存50天后仍能保持其最大活性的30%-40%（Xu等人，2024年）。其他實驗表明，固定在鐵和NaOH活化生物炭上的酶以及游離酶在儲存50天后分別保留了60%和30%的活性（Zheng等人，2023年）。先前的研究使用了在550°C下制備并經過酸處理的漆酶負載生物炭，用于修復水環境中的蒽。實驗發現，使用固定化酶可以在24小時內修復98%的蒽（Imam等人，2021年）；在48小時的水溶液實驗中，可以修復81.9%的蒽和69.2%的苯并[a]芘（Deng等人，2022年）。此外，固定在生物炭上的細菌在土壤中84天內可降解90-95%的PAHs（Guo等人，2022年）。經過90天的培養后，使用固定在生物炭上的Bacillus只能去除36.4%的PAHs（Song等人，2022a）。最近的一項研究使用預先用NaOH活化并在800°C下熱解的生物炭來修復土壤中的PAHs（Zheng等人，2023年）。然而，關于生物炭上酶的負載機制以及生物炭-固定化酶在土壤條件下的修復機制尚不完全清楚，因為缺乏在不同熱解溫度下制備生物炭以評估載體材料的結構和形態的信息，也常常忽視了酶與生物炭特性的相互作用。
生物質（包括動物和植物殘余物以及城市垃圾）是生物炭的主要來源，生物炭是一種富含碳的多孔材料（Sun等人，2025年；Yang等人，2021年）。由于其巨大的孔隙率、較大的表面積、增強的功能基團和非細胞毒性特性，熱解碳材料被廣泛用于微生物固定化研究（Deng等人，2024年；Sun等人，2025年）。除了作為載體外，生物炭還因其氧化還原活性表面基團或共軛碳結構而能夠充當電子穿梭載體（Sun等人，2017年，2025年）。例如，將Vibrio菌固定在生物炭上的研究觀察到其對柴油的吸附和降解作用（H. Zhou等人，2021年）。固定化微生物的功能表現很大程度上取決于載體的類型，此外，生物炭的性質也會隨著原料類型和熱解溫度的不同而發生顯著變化（Sun等人，2025年）。
目前，關于生物炭性質如何影響固定化酶（如漆酶）在碳氫化合物降解過程中的活性的認識仍有許多不足。本研究探討了在不同溫度下制備的不同生物炭上固定化的漆酶在芘污染土壤中的酶促和微生物代謝中的作用。本研究有三個具體目標：(a) 制備、表征和優化漆酶固定化生物炭；(b) 評估漆酶固定化生物炭對芘的酶促和微生物降解的影響；(c) 研究生物炭固定化漆酶在芘降解動力學中的作用；(d) 通過分析酶活性和細菌群落變化來闡明該系統促進降解的機制。這些技術為未來的研究提供了理論性和實驗性見解，有助于深入理解PAHs的修復機制和生物炭負載固定化技術的發展。
實驗材料
實驗所用化學品包括：純度為99%的芘、trametes versicolor來源的漆酶（≥ 0.5 U mg?1）、2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)、sigma-aldrich、戊二醛、甲醇、L-DOPA、2,3,5-triphenyltetrazdium chloride (TTC) 和 triphenyl formazen (TPF)，均由上海Macklin生化技術有限公司提供。
土壤樣品采集與處理
土壤樣本采集自中國四川省成都市雙流區順興路附近的蔬菜種植區，采集深度為0-20厘米。
活化生物炭和固定化酶的特性
不同溫度下的熱解可以改變生物炭的物理和化學性質。同時，酸處理可以去除生物炭孔隙中的非均勻物質、礦物質和雜質（Liu等人，2025年；Yang等人，2023年）。用酸處理小麥秸稈生物炭還可以改變其內部結構，為漆酶的固定提供支持（Imam等人，2021年；Yang等人，2023年）。結論
將酶系統與生物炭結合用于土壤修復是一種新興的尖端技術，它利用微生物和酶的代謝和分解反應來解毒受芘污染的土壤。生物炭固定的漆酶系統在惡劣條件下保護了酶的結構，保持了酶的活性和操作穩定性。這種生物工程系統能夠有效地完成降解任務。
CRediT作者貢獻聲明
Hui Ma： 方法學研究。Chenglong Yu： 形式分析。Nadeem Iqbal： 形式分析。You Wu： 實驗研究。Shiyong Sun： 監督與實驗研究。Babar Hussain： 文章撰寫、審稿與編輯、初稿撰寫、可視化效果、方法學研究、概念設計。Sami Ullah： 實驗研究。Shengyan PU： 文章撰寫、審稿與編輯、監督、資金申請。
未引用的參考文獻
Li等人，2022年；Liu等人，2023年；Wang等人，2023年；Zhou等人，2021年；Zhou等人，2024年；Zhou等人，2024年。
生成式AI和AI輔助技術的聲明
在準備本研究的過程中，作者使用了DeepSeek、QuillBot和Paperpal等工具，以提高工作效率、快速獲得關鍵見解并改進英語表達。使用這些工具/服務后，作者對內容進行了必要的審閱和編輯，并對發表文章的內容負全責。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究得到了國家自然科學基金（編號U22A20591、42077185）、國家重點研發計劃（編號2020YFC1808300）、地球災害預防與地質環境保護國家重點實驗室的研究基金（編號SKLGP2020Z002）以及四川省杰出青年學者科技計劃（編號2022ZYD0040、2022JDJQ0010）的支持。
