通過(guò)腸桿菌（Enterobacter cloacae TL3）的無(wú)細(xì)胞濾液實(shí)現(xiàn)的多重間接抗藍(lán)藻機(jī)制
《Environmental Research》：A multi-faceted indirect anticyanobacterial mechanism through cell-free filtrates of
Enterobacter cloacae TL3
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藍(lán)藻水華抑制機(jī)制研究：從太湖分離的 Enterobacter cloacae TL3 菌株通過(guò)無(wú)菌濾液引發(fā)多靶點(diǎn)抑制，早期（6h）調(diào)控光合系統(tǒng)I（PSI）及細(xì)胞防御基因表達(dá)，中期（12h）導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、類囊體膜解體及PSII電子傳遞受阻，并伴隨聚-β-羥丁酸（PHB）顆粒積累。轉(zhuǎn)錄組分析揭示細(xì)胞壁合成（C789_RS10970）、PSII結(jié)構(gòu)（psbC/d）及毒素合成相關(guān)基因（cmr4/ruvA）顯著下調(diào)。該研究首次闡明細(xì)菌代謝物誘導(dǎo)藍(lán)藻多層級(jí)損傷的時(shí)空調(diào)控機(jī)制，為水華治理提供新策略。
韓陽(yáng)|辛甘|鄭亞奇|劉彤|沈文婷|埃里克·耶佩森|張偉|王麗青
教育部水生遺傳資源勘探與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)，上海201306，中國(guó)
摘要
藍(lán)藻水華對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)健康和水質(zhì)構(gòu)成重大威脅。抗藍(lán)藻細(xì)菌在緩解水華方面具有潛力，但其對(duì)藍(lán)藻的時(shí)效性抑制機(jī)制仍知之甚少。本文從富營(yíng)養(yǎng)化的太湖中分離出一種強(qiáng)效的抗藍(lán)藻菌株Enterobacter cloacae TL3，并系統(tǒng)闡明了其對(duì)主要致水華藍(lán)藻Microcystis aeruginosa的多靶點(diǎn)時(shí)效性抑制機(jī)制。通過(guò)結(jié)合短期表型測(cè)定和時(shí)效性轉(zhuǎn)錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)TL3菌株的無(wú)菌濾液會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞損傷過(guò)程：6小時(shí)內(nèi)，M. aeruginosa的轉(zhuǎn)錄組發(fā)生顯著重組，主要影響光系統(tǒng)I（PSI）功能和細(xì)胞防御途徑；12小時(shí)后，顯微鏡觀察顯示細(xì)胞壁破裂、類囊體膜解體、PSI完全失活以及光系統(tǒng)II（PSII）的電子傳遞受阻。藍(lán)藻細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)，其特征是細(xì)胞內(nèi)聚β-羥基丁酸（PHB）顆粒增大，這與滲透壓平衡有關(guān)。轉(zhuǎn)錄組分析還發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞壁生物合成（C789_RS10970）、PSII結(jié)構(gòu)成分（psbC, psbD）、色素合成、自我防御及DNA修復(fù)（cmr4, ruvA）相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)。這些多層次的損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性崩潰。本研究揭示了E. cloacae TL3中先前未被認(rèn)識(shí)的多靶點(diǎn)抗藍(lán)藻機(jī)制，為開(kāi)發(fā)可持續(xù)策略以減輕富營(yíng)養(yǎng)化水體中的藍(lán)藻水華提供了新見(jiàn)解。
引言
近年來(lái)，由于富營(yíng)養(yǎng)化和氣候變化導(dǎo)致的水文及溫度模式變化，全球范圍內(nèi)的藍(lán)藻有害藻華（cyanoHABs）問(wèn)題日益嚴(yán)重（Glibert和Burford，2017）。據(jù)估計(jì)，目前全球超過(guò)60%的淡水水體受到藍(lán)藻水華的影響，僅在美國(guó)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失就超過(guò)20億美元，歐洲和亞洲的情況也類似或更為嚴(yán)重（Huisman等人，2018；Amorim和Moura，2021；Hou等人，2022）。一個(gè)典型的例子是2007年太湖中以Microcystis為主導(dǎo)的水華，導(dǎo)致無(wú)錫市持續(xù)一周的飲用水危機(jī)，影響超過(guò)兩百萬(wàn)居民，凸顯了藍(lán)藻水華對(duì)公共健康和水質(zhì)安全的嚴(yán)重威脅（Qin等人，2010；Guo，2007）。此外，在快速城市化地區(qū)，其他致水華菌屬（如Raphidiopsis raciborskii和Umezakia ovalisporum）的地理分布范圍不斷擴(kuò)大，其優(yōu)勢(shì)地位日益明顯（Akcaalan等人，2014；Mohamed等人，2018）。因此，制定有效且可持續(xù)的藍(lán)藻水華緩解策略已成為全球性緊迫任務(wù)。
在自然系統(tǒng)中，藍(lán)藻水華的減少通常與異養(yǎng)細(xì)菌群落的改變相關(guān)，其中包含許多抗藍(lán)藻的細(xì)菌類群（Coyne等人，2022）。這些微生物是藍(lán)藻水華消退和分解的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素（Chen等人，2020；Van Wichelen等人，2016），因此是傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)削減策略的有力補(bǔ)充。已有研究表明，Bacillus、Pseudomonas、Streptomyces和Enterobacter等屬的細(xì)菌具有抗藍(lán)藻活性，某些菌株通過(guò)直接接觸、分泌代謝物或綜合機(jī)制發(fā)揮殺菌作用（Kong等人，2022；Morón-López等人，2024）。例如：Bacillus cereus N-14通過(guò)細(xì)胞外分泌物溶解Microcystis（Nakamura等人，2003）；Streptomyces sp. HY有效殺死了R. raciborskii（Xie等人，2024）；Bacillus flexus既能溶解R. raciborskii細(xì)胞，又能降解其產(chǎn)生的圓柱孢素毒素（Mohamed等人，2022）。盡管取得這些進(jìn)展，但細(xì)菌抗藍(lán)藻活性的機(jī)制基礎(chǔ)仍不充分明確。
許多研究側(cè)重于抗藍(lán)藻細(xì)菌本身或其表型效應(yīng)，而很少整合藍(lán)藻細(xì)胞死亡的分子、結(jié)構(gòu)和時(shí)間途徑。例如，抗藍(lán)藻作用可能涉及直接物理攻擊（Shilo，1970）、特定生物活性肽的分泌（Imamura等人，2001），或直接-間接機(jī)制的結(jié)合（Xie等人，2024）。其他研究報(bào)道了細(xì)菌代謝物引起的光合作用電子傳遞抑制、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)或結(jié)構(gòu)崩潰（Zhang等人，2021；Font-Najera等人，2024）。然而，轉(zhuǎn)錄擾動(dòng)如何引發(fā)生理應(yīng)激反應(yīng)并最終導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)損傷仍不清楚，這限制了對(duì)抗藍(lán)藻細(xì)菌如何協(xié)調(diào)藍(lán)藻裂解機(jī)制的理解。
本研究從太湖中分離出一種高效且特異性針對(duì)藍(lán)藻的抗藍(lán)藻菌株，并研究了其對(duì)模型致水華藍(lán)藻M. aeruginosa的生長(zhǎng)、生理和轉(zhuǎn)錄組的影響。我們旨在描述從基因改變到功能缺陷直至細(xì)胞損傷的連續(xù)事件鏈，這些變化由細(xì)菌代謝物引發(fā)。我們假設(shè)短期接觸抗藍(lán)藻分泌物會(huì)快速破壞關(guān)鍵光合基因（如psbA, rbcL）和自我防御基因，進(jìn)而加劇后續(xù)的超微結(jié)構(gòu)損傷和代謝功能障礙。本研究擴(kuò)展了可用于生物防治藍(lán)藻水華的微生物資源，并提供了抗藍(lán)藻細(xì)菌發(fā)揮抑制作用的具體機(jī)制。
章節(jié)摘要
高效特異性抗藍(lán)藻菌株的分離與篩選
2021年9月，在太湖美良灣（31°24’N, 120°13’E）以Microcystis為主導(dǎo)的水華期間，通過(guò)連續(xù)清洗并將菌液接種在Luria-Bertani（LB）瓊脂上，分離出了抗藍(lán)藻菌株。LB瓊脂用于選擇性回收生長(zhǎng)迅速、可培養(yǎng)的異養(yǎng)細(xì)菌，以便后續(xù)分離和實(shí)驗(yàn)操作。所得菌株在37°C、180 rpm條件下培養(yǎng)12小時(shí)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段后進(jìn)行進(jìn)一步研究
TL3菌株的特性、抗藍(lán)藻活性及安全性
我們從Microcystis水華樣本中分離出TL3菌株，該菌株表現(xiàn)出顯著的抗藍(lán)藻效果（R=100%，t = 8天）（表S2，圖S1）。TL3菌株為革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌（圖S2a和1b），在37°C、180 rpm條件下培養(yǎng)12小時(shí)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段（圖S3）。該菌株能耐受25至40°C的溫度（圖S4a）、0至5%的鹽度（圖S4b）以及6.0至9.0的pH值（圖S4c）。最佳生長(zhǎng)條件為
Enterobacter cloacae TL3：一種具有廣譜抗藍(lán)藻活性且環(huán)保的安全菌株
藍(lán)藻水華的頻繁發(fā)生凸顯了高效且環(huán)保的控制策略的必要性。本研究分離出了E. cloacae TL3菌株，該菌株對(duì)M. aeruginosa具有顯著的抗藍(lán)藻活性。盡管在Enterobacter屬中僅有少數(shù)研究記錄了抗藍(lán)藻效應(yīng)（He等人，2021；Lu等人，2021；Zhang等人，2022），但已有報(bào)道表明相關(guān)菌株E. cloacae NP23也能抑制某些綠藻
結(jié)論
我們從太湖中分離出具有強(qiáng)效且環(huán)保抗藍(lán)藻活性的Enterobacter cloacae TL3菌株，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，其無(wú)細(xì)胞代謝物可快速破壞藍(lán)藻的細(xì)胞完整性和光合作用電子傳遞，同時(shí)引發(fā)氧化應(yīng)激。轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步揭示了關(guān)鍵抗性機(jī)制的多層次紊亂
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
韓陽(yáng)：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿，數(shù)據(jù)可視化，方法學(xué)，數(shù)據(jù)管理。辛甘：方法學(xué)，正式分析，數(shù)據(jù)管理。王麗青：撰寫 – 審稿與編輯，資源協(xié)調(diào)，項(xiàng)目管理，概念構(gòu)思。張偉：撰寫 – 審稿與編輯，資源協(xié)調(diào)，項(xiàng)目管理，資金爭(zhēng)取，概念構(gòu)思。沈文婷：軟件使用，方法學(xué)。埃里克·耶佩森：撰寫 – 審稿與編輯。鄭亞奇：方法學(xué)，
未引用的參考文獻(xiàn)
Harke等人，2016；Acinas等人，2009；Crawford等人，2017；Xie等人，2018；Mohamed和Bakr，2018；Chorus和Welker，2021；Wichelen等人，2016；Nakamura等人，2023；Font-Nájera等人，2024；中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，2008；中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，2014；Nair和Steven，2004。
利益沖突聲明
作者聲明沒(méi)有已知的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系可能影響本文的研究結(jié)果。
致謝
本研究得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFC2601305）和國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)41901119和U23A20153）的支持。感謝戴正峰、葉曉琳、劉琪、孫澤東、曾志偉和王文倩在藍(lán)藻和細(xì)菌培養(yǎng)及藻類計(jì)數(shù)方面的幫助。同時(shí)，也非常感謝奧胡斯大學(xué)的Anne Mette Poulsen在英語(yǔ)協(xié)助方面的支持。
