《Food Bioscience》：Systematic engineering of
Bacillus amyloliquefaciens for efficient bovine lactoferrin production
編輯推薦：
利用畢赤酵母分泌表達系統通過優化核糖體結合位點、設計新型信號肽及共表達分子伴侶實現牛乳鐵蛋白高效生產，5升生物反應器中最終產量達110 mg/L，為功能性蛋白發酵提供新策略。
李穎|李珍|毛素陽|杜珊珊|李莎|徐虹|雷鵬|邱一斌
南京工業大學食品科學與輕工學院，中國南京211816
摘要
牛乳鐵蛋白（BLF）是一種高價值的多功能蛋白質，以其鐵結合能力和廣譜抗菌特性而聞名。盡管它作為一種功能性食品成分具有潛力，但由于天然來源中含量低且提取成本高，其工業應用受到限制。為了解決這一瓶頸，本研究首次成功地在公認安全（GRAS）宿主Bacillus amyloliquefaciens中實現了重組BLF的分泌表達。最初，工程菌株的產量為18.0 ± 0.3 mg/L。為了提高分泌效率，采用了系統工程優化策略，包括優化核糖體結合位點（RBS）并融合一種新的植酸酶衍生信號肽（SPphy）以促進轉運。關鍵的是，還共表達了分子伴侶PrsA以減輕折疊壓力。這些改進最終使產量提高了6.1倍，在5升生物反應器中達到了110.0 ± 0.8 mg/L的最終產量。這項研究不僅證明了B. amyloliquefaciens作為BLF生產平臺的可行性，還為其他復雜營養蛋白的異源生物制造提供了戰略框架。
引言
牛乳鐵蛋白（BLF）是一種非血紅素鐵結合蛋白，屬于轉鐵蛋白家族（Cui等人，2022；González-Chávez等人，2009）。結構上，BLF由兩個同源的葉狀結構（N-葉和C-葉）通過一個靈活的α-螺旋連接而成，每個葉狀結構都能可逆地結合Fe3+并協同作用（Baker & Baker，2009；Moore等人，1997）。這種獨特的鐵螯合能力不僅提高了鐵的生物利用度，還通過穩定游離鐵來減輕胃腸道刺激（Berlov等人，2007）。除了鐵穩態外，BLF還具有廣泛的生理活性，包括抗氧化、抗菌、免疫調節和益生元作用（Actor等人，2009；Dyrda-Terniuk & Pomastowski，2023；Wallace，2016）。因此，BLF已成為功能性食品、嬰兒配方奶粉和臨床營養中的高價值成分。隨著健康意識的提高，預計到2032年全球BLF市場將達到9.699億美元（Ostrowska等人，2025）。然而，目前的工業供應主要依賴于從牛奶或乳清中提取。這種方法受到天然含量低、純化成本高和顯著環境足跡的阻礙（Hu等人，2024）。這些供應方面的瓶頸需要開發可持續、可擴展的生物技術替代方案。
合成生物學為BLF的精準發酵提供了有前景的途徑，可以實現可控、高效且環境可持續的制造過程。然而，確定最佳表達宿主仍然是一個挑戰。大腸桿菌作為重組蛋白合成的主要宿主之一，由于其復雜的遺傳工具箱、易于培養的協議以及在大規模發酵過程中的經濟可行性，一直是最早研究BLF表達的平臺之一。例如，Montoya等人將硫氧還蛋白（Trx）與全長牛乳鐵蛋白融合并在E. coli中表達，獲得了15.3 mg/L的重組BLF產量，純度為90.3%（García-Montoya等人，2013）。重組E. coli經常產生不溶性的包涵體，因此需要復雜的重折疊程序。此外，革蘭氏陰性細菌中的內毒素存在對食品級應用的安全性構成威脅。因此，已經使用了其他細菌表達系統，如Rhodococcus erythropolis，用于BLF C-葉片段的異源表達，并通過逐步透析方法成功獲得了生物活性C-葉（W. S. Kim等人，2006）。此外，Komagataella phaffii菌株GS115（以前稱為Pichia pastoris）是最廣泛使用的真核表達宿主之一，用于BLF生產。利用pPIC9K載體并實施密碼子優化和基因劑量調整等策略，該系統實現了高達824.93 mg/L的最終BLF產量（Zhang等人，2025）。然而，這一過程通常需要7-9天，且相對復雜，同時目標蛋白的細胞內積累往往限制了產量并增加了純化的難度。因此，迫切需要一種具有公認安全（GRAS）狀態的微生物平臺，能夠高效分泌生物活性BLF并縮短發酵時間。Bacillus amyloliquefaciens是一種GRAS狀態的革蘭氏陽性細菌，由于其快速生長、食品安全性和強大的分泌能力，成為功能性蛋白的理想候選者（Luo等人，2023）。目前，源自B. amyloliquefaciens的新型表達細胞工廠已成功應用于多種酶的生物合成，包括α-淀粉酶（Li等人，2025）、蛋白酶（Jiang等人，2022）和纖維素酶（Bhatt等人，2024）。通過機器學習模型預測和設計新的信號肽顯著提高了該細胞工廠中重組蛋白的分泌效率（Li等人，2025）。為了評估這種新型B. amyloliquefaciens宿主菌株合成BLF的潛力，我們實施了一系列系統優化策略，包括篩選最佳分泌表達宿主、設計重組表達元件以及優化BLF的翻譯、分泌和折疊過程。這種方法旨在解決重組BLF在微生物表達宿主中面臨的關鍵問題，如溶解度差、分泌效率低和產量不足。最終，我們建立了一種高效的生物技術合成途徑，適用于從食品級原料直接生產BLF。這種方法為當前的動物基供應鏈提供了可行的替代方案，并為BLF的發酵生產提供了實用的解決方案。
部分內容摘錄
細菌菌株、質粒和化學品
大腸桿菌 DH5α（Invitrogen，上海，中國）用于基因克隆和質粒構建，而E. coli GM2163用于質粒去甲基化。B. subtilis 168和B. amyloliquefaciens SE被用作表達宿主。編碼牛乳鐵蛋白（BLF；NCBI編號JX294418.1）的基因經過密碼子優化，并由General Biosystems（中國滁州）化學合成。3-植酸酶基因（phy）從B. amyloliquefaciens SE的基因組DNA中擴增
重組BLF表達宿主的篩選和評估
Bacillus屬細菌具有強大的天然分泌機制，包括專門的信號肽和伴侶蛋白，有助于蛋白質直接轉移到細胞外環境中。這種分泌能力簡化了下游純化過程，并通常促進蛋白質的正確折疊（Yang等人，2021）。為了選擇最佳宿主，使用含有AmyE的IPTG誘導pHT43載體評估了兩種食品級菌株B. subtilis 168和B. amyloliquefaciens SE
結論
目前BLF的微生物合成面臨諸多挑戰，包括產量低、生產成本高和生物活性不穩定。因此，開發最佳表達宿主是BLF生物技術研究的關鍵焦點。為了解決這些問題，采用了系統工程方法，將B. amyloliquefaciens確立為BLF生產的宿主平臺。該策略包括篩選功能性
CRediT作者貢獻聲明
杜珊珊：撰寫 – 審稿與編輯，項目管理。李莎：監督，資金獲取，概念構思。毛素陽：方法學，研究，數據管理。邱一斌：監督，資金獲取，概念構思。徐虹：撰寫 – 審稿與編輯，項目管理。雷鵬：監督，資金獲取，概念構思。李穎：撰寫 – 初稿，軟件開發，方法學，研究，數據管理，概念構思。李珍：軟件開發
未引用的參考文獻
Genoud等人，1999；Masson和Heremans，1971；Montreuil等人，1960；Wang等人，2025；Zhang等人，2025。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
本工作得到了中國國家重點研發計劃（2023YFF1103400）和江蘇合成生物學基礎研究中心（編號BK20233003）的支持。
