3-羥基-3-甲基丁酸（HMB）是一種源自必需氨基酸L-亮氨酸的關(guān)鍵內(nèi)源性代謝物，由于其強(qiáng)大的蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用，在食品和健康產(chǎn)業(yè)中成為了一種關(guān)鍵的生物活性化合物（Gepner等人，2019年；Rowlands和Thomson，2009年；Wilson等人，2008年）。HMB具有通過mTORC1途徑刺激肌肉蛋白合成（Wilkinson等人，2013年）和通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)抑制蛋白水解（Nissen等人，1996年；Smith等人，2005年）的雙重功能，是管理肌少癥和提升運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的重要營養(yǎng)干預(yù)措施（Robinson等人，2014年）。HMB的安全性和有效性已得到廣泛驗(yàn)證，美國將其列為“公認(rèn)安全”（GRAS）食品，中國衛(wèi)生部也在2011年批準(zhǔn)其作為新型資源食品（Zhou等人，2025年）。隨著其應(yīng)用范圍從醫(yī)療營養(yǎng)擴(kuò)展到畜牧業(yè)（Wan等人，2016年；Zabek等人，2016年），全球?qū)�HMB的需求正在激增。這種快速的市場擴(kuò)張凸顯了開發(fā)高效、高產(chǎn)生物合成策略的緊迫性，以確保可持續(xù)和具有成本效益的供應(yīng)。

目前，HMB的工業(yè)生產(chǎn)主要依賴于化學(xué)合成方法，通常使用次鹵酸鹽（如NaOCl或NaOBr）通過鹵仿反應(yīng)氧化二丙酮醇（DAA）（Lawrence W. McCoy等人，2002年）。盡管這種方法已經(jīng)成熟，但它存在顯著缺點(diǎn)，包括難以控制放熱反應(yīng)、產(chǎn)生有毒的鹵代副產(chǎn)物以及嚴(yán)重的環(huán)境污染，需要復(fù)雜的下游純化過程。為了解決這些可持續(xù)性問題，微生物生物合成成為了一個(gè)有前景的替代方案。一種微生物發(fā)酵策略利用Galactomyces reessii的內(nèi)源途徑將β-甲基丁酸（MBA）轉(zhuǎn)化為HMB，在136小時(shí)的發(fā)酵后可獲得38 g/L的產(chǎn)量，摩爾轉(zhuǎn)化率為50%，生產(chǎn)率為0.28 g/(L·h)（Hasegawa等人，1981年；Lee等人，1997年）。然而，這種方法面臨底物異味、操作復(fù)雜性和競爭性代謝途徑等問題。另一種微生物平臺(tái)是在E. coli中通過甲羥戊酸途徑使用葡萄糖作為碳源進(jìn)行轉(zhuǎn)化的。在1-L生物反應(yīng)器中，128小時(shí)的培養(yǎng)產(chǎn)生了17.7 g/L的HMB，葡萄糖轉(zhuǎn)化效率為0.16 g/g，生產(chǎn)率為0.14 g/(L·h)（Huang等人，2024年），但由于脫羧酶的雜項(xiàng)活性導(dǎo)致副產(chǎn)物積累，使得下游處理變得復(fù)雜。

通過L-氨基酸脫氨酶（L-AAD）和4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶（4-HPPD）的協(xié)同作用，建立了一個(gè)酶級聯(lián)平臺(tái)。L-AAD首先將L-亮氨酸轉(zhuǎn)化為亞胺中間體，該中間體自發(fā)水解為α-酮異己酸（α-KIC），隨后4-HPPD催化氧化脫羧生成HMB。通過對Rattus norvegicus中的RnHPPD進(jìn)行Q341A突變，減少了底物通道的空間阻礙，使酶活性比野生型提高了20%。在表達(dá)RnHPPD^Q341A（OD₆₀₀ = 45）的E. coli Rosetta（DE3）菌株和Proteus vulgaris L-AAD（OD₆₀₀ = 35）進(jìn)行10小時(shí)的共培養(yǎng)后，產(chǎn)生了1.4 g/L的HMB，生產(chǎn)率為0.14 g/(L·h)（Gao & Li，2021年）。最近，從Bacteroides barnesiae（BbHPPD）中鑒定出一種高效的4-HPPD，并將其與Proteus mirabilis L-AAD結(jié)合在E. coli BL21(DE3)中。通過迭代飽和突變得到的工程變體BbHPPD^M4，相對于野生型，α-KIC的產(chǎn)量提高了254%。使用20 g/L的L-亮氨酸作為底物，該系統(tǒng)在18小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生了11.6 g/L的HMB，摩爾轉(zhuǎn)化率為65%，生產(chǎn)率為0.64 g/(L·h)（Chen等人，2025年）。然而，這些研究主要集中在分子層面的酶挖掘和工程上，較少關(guān)注多酶級聯(lián)反應(yīng)中表達(dá)元件的系統(tǒng)調(diào)控。此外，對于工業(yè)生物催化而言，熱穩(wěn)定性直接關(guān)系到生物催化劑的壽命和穩(wěn)定性；因此，全細(xì)胞催化過程中酶失活和不穩(wěn)定性的問題值得高度重視。最近的酶工程方法進(jìn)展改變了傳統(tǒng)方法，使得能夠設(shè)計(jì)出具有更高特異性、穩(wěn)定性和催化效率的酶（Qu等人，2025年）。因此，通過這些先進(jìn)策略對目標(biāo)酶進(jìn)行工程改造，為同時(shí)提高催化效率和熱穩(wěn)定性提供了戰(zhàn)略機(jī)會(huì)。

在本研究中，系統(tǒng)整合了途徑工程和酶工程以實(shí)現(xiàn)高效的HMB生物合成。我們證明了優(yōu)化表達(dá)盒內(nèi)的基因順序和RBS序列可以將轉(zhuǎn)化率提高兩倍以上。此外，針對遠(yuǎn)端和近端位點(diǎn)的組合突變策略同時(shí)提高了限速酶的熱穩(wěn)定性和酶活性。我們的研究為協(xié)調(diào)優(yōu)化生物催化級聯(lián)中的各個(gè)酶以及提高限速酶的催化活性和熱穩(wěn)定性提供了有價(jià)值的策略。

與以往的研究相比，本研究整合了系統(tǒng)途徑工程和雙重屬性酶工程。我們證明了優(yōu)化基因順序和組合RBS調(diào)節(jié)可以將摩爾轉(zhuǎn)化率提高兩倍以上。具體而言，這種協(xié)同表達(dá)是主要驅(qū)動(dòng)力，使轉(zhuǎn)化率相對提高了63.29%（從最初的34.6%提高到56.5%）。此外，組合突變策略同時(shí)提高了限速酶AaHPPD的熱穩(wěn)定性和催化活性，進(jìn)一步提高了14.91%。本研究不僅在10小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了73.73%的高摩爾轉(zhuǎn)化率，還為復(fù)雜生物催化級聯(lián)中平衡酶表達(dá)和穩(wěn)定性提供了系統(tǒng)性的路線圖。