《Food and Chemical Toxicology》：Toxicity of polyethylene terephthalate and polylactic acid nanoplastics, pristine and weathered in environmentally-relevant conditions, to human intestinal cells representative of genetic susceptibility to Crohn's disease.
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微納米塑料（PET/PLA）在體外腸道模型中的毒性評估顯示，無論是否經歷環境降解，均未顯著影響細胞毒性、遺傳毒性或氧化應激，但在遺傳易感模型中觀察到部分屏障功能變化。
作者名單：Verane Bard | Margaux Papin | Maeva Boulée | Marion Berenguer | Aliro Villacorta | Daphna Fenel | Emma Dusacq | Ricard Marcos | Alba Hernández | Jacques-Aurélien Sergent | Thierry Douki | Marie Carrière
研究機構：格勒諾布爾阿爾卑斯大學（Université Grenoble Alpes）、法國原子能委員會（CEA）、法國國家科學研究中心（CNRS）、格勒諾布爾高等理工學院（Grenoble-INP）、IRIG、SyMMES-CIBEST，法國格勒諾布爾，郵編38000
摘要
微塑料和納米塑料（MNPs）對環境的污染引發了人們對它們對人體毒性的擔憂，尤其是通過攝入途徑。雖然關于原始微塑料的影響已有大量研究記錄，但環境降解后的微塑料卻仍缺乏足夠研究。我們評估了可生物降解和不可生物降解的納米塑料（NPLs），即聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚乳酸（PLA），在原始狀態以及經過環境條件作用后的影響。我們使用HT29-MTX細胞與表達野生型或突變型核苷酸結合寡聚化結構域2（NOD2）的Caco-2細胞共培養，構建了一個代表健康人群的體外腸道模型，并將其與易患炎癥性腸病（IBD）的遺傳易感模型進行了比較。未分化和已分化的細胞分別暴露于這些NPLs 24小時后，對其細胞攝取、細胞毒性、基因毒性、氧化應激、炎癥反應以及上皮屏障完整性進行了檢測。盡管PET和PLA在細胞內積累，但并未表現出顯著的毒性。因此，與聚苯乙烯NPLs的研究結果一致，PLA和PET顆粒在體外急性暴露下不會對腸道細胞造成重大毒性影響，而且在這種暴露條件下，環境降解并不會增加它們的毒性。
引言
日常生活中一次性塑料制品的大量使用，加上不良的廢物管理，導致塑料垃圾在自然環境中（如土壤、河流、海洋）積聚，進而使生活在這些生態系統中的動物受到污染，而這些動物又可能進入人類食物鏈。一旦進入環境，塑料會在陽光、微生物以及機械和熱應力的作用下分解成更小的顆粒——即微塑料和納米塑料（MNPs），從而改變其物理化學性質[1]。人類通過飲用儲存在塑料瓶中的飲料或食用包裝在塑料容器中的食物而暴露于這些顆粒。據估計，每年通過飲用受污染的自來水，人類會攝入458,000個MNPs；而飲用瓶裝水則會攝入超過300萬個MNPs，其中大部分為聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）[2]。將沸水倒入塑料杯或聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）涂層紙杯中，或者將水倒在聚乳酸（PLA）制成的茶包上，也會釋放出一些MNPs并被人體攝入[3]。此外，人類呼吸的空氣中也含有來自含有聚合物材料的磨損產生的塑料顆粒，例如汽車輪胎或合成紡織品，這些材料同樣會受到環境因素的進一步降解。總體而言，人類可通過皮膚接觸、吸入受污染的空氣、飲用受污染的水或食用受污染的食物（如生活在受污染環境中的魚類或無脊椎動物）而暴露于MNPs[4]。已在人體組織中檢測到MNPs[5]，這證明了它們能夠穿越生物屏障并到達遠端器官。MNPs最終通過糞便排出體外，其平均濃度估計在每克濕重2個到28個顆粒之間，其中主要是PET顆粒[6, 7]。研究表明，炎癥性腸病（IBD）患者的糞便中MNPs濃度顯著高于健康個體[7]，這引發了人們對MNPs對健康人群（尤其是IBD患者）影響的擔憂。
關于聚苯乙烯（PS）的大量研究揭示了MNPs在消化道中的行為。當小鼠口服PS MNPs（直徑20至5000納米）時，這些顆粒會在腸道內積聚，引發炎癥并破壞腸道屏障功能[8, 9]，并穿過腸道上皮進入血液。體外實驗中，在代表健康人群的細胞模型中，觀察到一些細胞毒性、自噬誘導、DNA損傷和炎癥現象，尤其是在暴露于胺功能化PS的細胞中[10, 11]，重復暴露時這種效應更為明顯[12, 13]。盡管部分研究未發現顯著影響，但大多數研究仍指出MNPs會在細胞內積累。關于PLA和PET顆粒的毒性，目前了解甚少。體內實驗表明，PLA MNPs會釋放寡聚物，導致小鼠腸道損傷和急性炎癥[14]。PET MNPs會增加海洋輪蟲Brachionus koreanus中的活性氧水平和谷胱甘肽S-轉移酶活性[15]。體外實驗中，從茶包中提取的真實PLA NPLs除了輕微破壞Caco-2/HT29細胞屏障外，未表現出其他細胞毒性效應[3]。真實的PET NPLs不會產生毒性作用，但能在溶酶體類似液體中持續存在，并有效穿過重組的腸道上皮[16]。它們還能刺激線粒體呼吸并促進氧化磷酸化產生的ATP生成[17]。此外，Bhas 42細胞轉化實驗中還報道了PET NPL的致癌潛力[12]。
迄今為止發表的大多數研究都是在體外腸道模型上進行的，這些模型代表健康個體，并且暴露于原始狀態的MNPs。實際上，人類接觸的塑料大部分是在進入體內之前就已經在環境中降解的。我們最近的研究表明，人工模擬的環境降解過程會導致PET和PLA NPLs釋放寡聚物[18]，這可能增加了它們的毒性，從而強調了評估原始狀態和降解狀態NPLs影響的重要性，以便全面了解它們對人類健康的潛在影響。
本研究的目的是評估體外腸道模型（代表健康個體或具有克羅恩病遺傳易感性的人群）對原始狀態及環境降解后的PET和PLA NPLs的反應。為此，我們使用了轉染了野生型核苷酸結合寡聚化結構域2（NOD2WT）或NOD21007fs突變的Caco-2細胞，這些細胞與分泌黏液的HT29-MTX細胞共培養[26]。NOD2突變與克羅恩病有關[19]，約30-40%的克羅恩病患者至少攜帶該基因的一個突變[20]。NOD2是一種能夠識別細菌細胞壁中的胞壁二肽（MDP）的蛋白質，通過激活NF-kB和MAPK信號通路引發炎癥[21]。NOD2的1007fs突變會導致NOD2蛋白截短，失去識別MDP的能力，進而無法激活NF-κB信號通路[23]。本研究探討了在環境相關條件下，一種可生物降解的NPL（PET）和一種不可生物降解的NPL（PLA）的體外腸道毒性。同時，通過比較易感和非易感體外模型的暴露結果，評估了克羅恩病遺傳易感性對腸道敏感性的影響。
PLA顆粒（CAS編號26100-51-6），直徑分別為120納米、200納米和450納米，有非熒光和黃綠色熒光兩種類型，購自Adjuvatis（法國里昂）。真實的PET顆粒（CAS編號25038-59-9）取自水瓶，用于本文描述的所有物理化學特性和毒性測試（Villacorta等人，2022年），這些顆粒被標記了iDye Pink以觀察細胞內吞作用和積累情況[24]
原始狀態及老化后的PET和PLA NPs的物理化學特性
原始狀態和老化后的PLA和PET NPLs均通過透射電子顯微鏡（TEM）進行了成像（圖1A-H）。無論直徑如何，原始狀態的PLA NPLs均為球形且大小均勻，存在輕微差異（圖1A-C）。TEM圖像顯示，其平均直徑略小于供應商提供的數值：113納米而非120納米，185納米而非200納米，374納米而非450納米。相比之下，原始狀態的PET顆粒呈現為納米級顆粒的密集聚集體（圖1）
最近關于人類通過受污染的水和食物攝入MNPs的估計引發了人們對塑料顆粒對腸道整體毒性的擔憂。然而，迄今為止，PET和PLA的毒性仍鮮有研究。本研究為PET和PLA NPLs對兩種體外人類腸道上皮模型的影響提供了新的見解，這兩種模型分別代表具有克羅恩病遺傳易感性和無易感性的人群。
本研究提供了關于原始狀態及環境降解后的PET和PLA NPLs在體外模型中對健康個體和具有克羅恩病遺傳易感性人群的腸道毒性的寶貴數據。盡管有證據表明這些顆粒會被細胞內吞，但在所使用的暴露條件和特定細胞模型中，除PET顆粒外，未觀察到任何毒性效應
Marie Carrière：撰寫、審稿與編輯、初稿撰寫、數據可視化、結果驗證、項目監督、方法論制定、概念構思。
Verane Bard：撰寫、審稿與編輯、初稿撰寫、數據可視化、實驗設計、數據分析。
Jacques-Aurélien Sergent：撰寫、審稿與編輯、結果驗證、項目監督、方法論制定、概念構思。
Thierry Douki：撰寫、審稿與編輯、數據可視化、結果驗證、項目監督、方法論制定。
作者聲明沒有需要披露的利益關系。
本研究是在PLASTOX項目框架下進行的，該項目獲得了法國國家研究機構（ANR）的資助（PLASTOX項目編號ANR-21-CE34-0028-02）、法國國家環境與衛生安全局（ANSES）的資助（EXMINA項目編號PNR EST-21-077），以及歐盟“地平線2020”研究與創新計劃的資助（項目編號965196，項目名稱PLASTICHEAL）。
作者聲明沒有已知的可能影響本文研究的財務利益或個人關系。
本項目得到了MuLife成像設施和CEA流式細胞術設施的支持，這些設施由格勒諾布爾阿爾卑斯大學化學生物學研究生院（GRAL項目，編號ANR-17-EURE-0003）資助。研究還利用了格勒諾布爾Instruct-ERIC中心（ISBG；UAR 3518，隸屬于CNRS、CEA和EMBL）的電子顯微鏡設施，該設施得到了法國綜合結構生物學基礎設施（FRISBI；編號ANR-10-INSB-05-02）和GRAL項目的支持。
