《International Dairy Journal》：Conformational remodeling of α-Lactalbumin by glycyrrhizin under acidic pH for enhanced emulsion stabilization: Unravelling the mechanisms by integrated experimental and computational approaches
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α-乳清蛋白與甘草酸在酸性條件下的協同乳化機制研究，通過實驗和分子動力學模擬發現pH 2.0-7.0調控蛋白構象與靜電作用，形成更穩定的復合物，顯著降低乳滴尺寸，增強抗 creaming 和抗離心能力。關鍵因素包括氫鍵網絡重塑、疏水相互作用增強及溶劑可及性改變。
作者：史瑞杰 | 高增利 | 元麗霞 | 李寧 | 江占梅 | 穆志深
內蒙古蒙牛乳業（集團）有限公司國家企業技術中心，中國呼和浩特市 011500
摘要
本研究探討了酸性pH值（范圍從7.0到2.0）對α-乳白蛋白（α-La）與甘草苷（Gy）相互作用的影響，以及這種影響對乳液穩定性的作用。綜合實驗結果和分子動力學（MD）模擬表明，由羧基質子化引發的α-La結構展開破壞了氫鍵網絡和主鏈二級結構。甘草苷的存在促進了β-折疊片的形成，減少了無規卷曲結構的比例，并通過疏水作用和氫鍵作用增強了結構的剛性。因此，乳化性能顯著提高，α-La–Gy復合物表現出更小的液滴尺寸、更高的ζ電位值，以及更強的抗乳化分層、離子強度和離心應力能力。盡管DLVO理論分析表明在等電點附近由于靜電排斥力不足會導致顆粒聚集，但甘草苷有效恢復了靜電排斥力，并在高度酸性條件下提供了額外的空間穩定作用。MD模擬還證實，在低pH值下溶劑可及性增加，油水界面吸附增強。主成分分析確定ANS結合、氫鍵作用和溶劑可及表面面積是關鍵的穩定性因素。這些發現為設計基于蛋白質的乳化劑提供了分子層面的見解，對于穩定酸化乳制品（如酸奶飲料和強化乳制品）具有重大潛力。
引言
基于乳液的食物（如牛奶飲料、涂抹醬和醬料）由于油滴的高表面積而本質上具有熱力學不穩定性，這會導致聚集、合并和相分離（McClements等人，2007；Zhang、Feng和Zhang，2018）。通常使用乳化劑（包括蛋白質（例如乳清蛋白、大豆蛋白）或小分子表面活性劑（例如吐溫、卵磷脂）來降低界面能并在液滴周圍形成保護層（Cai等人，2023；Fan等人，2022）。然而，消費者對清潔標簽和天然成分的需求增加推動了研究向生物相容的、基于植物的合成表面活性劑替代品的發展。在這種情況下，天然生物聚合物和生物表面活性劑的協同組合為開發高性能乳化劑提供了有前景的策略（Derkatch等人，2007；de Faria等人，2017；Marhamati、Ranjbar和Rezaie，2021）。特別是基于蛋白質-皂苷的乳化劑因其能夠結合蛋白質的優異成膜性能和粘彈性以及天然皂苷的高表面活性和固有的空間穩定能力而受到廣泛關注。這種協同作用彌補了各組分的局限性：皂苷促進快速界面吸附并提供靜電或空間排斥力，而蛋白質則作為結構支架，形成具有增強機械強度的致密彈性界面膜，從而提高乳液和泡沫的穩定性（Li等人，2023）。
蛋白質-皂苷系統中的結合和共吸附行為主要由非共價相互作用控制，包括疏水作用、氫鍵作用和靜電作用（Li等人，2023；Kezwon和Wojciechowski，2014）。皂苷的疏水苷元傾向于與蛋白質表面的非極性區域或其疏水核心相互作用，而糖基部分可以與極性蛋白質殘基形成氫鍵。這些相互作用對環境條件（特別是pH值）非常敏感，pH值會調節兩種組分的電離狀態、蛋白質構象、凈電荷以及靜電吸引或排斥（Idrees等人，2017；Waseem等人，2022）。這種pH依賴性為合理設計具有定制功能的復合物提供了關鍵機會。為了滿足消費者對天然和健康成分的需求，乳清蛋白因其優異的營養價值和功能特性而受到廣泛關注（Hao等人，2025）。其中，α-乳白蛋白（α-La）是一種小的鈣結合球狀蛋白，具有明確的疏水結合口袋，能夠與多種生物活性化合物相互作用，使其成為與疏水配體形成復合物的理想候選者（Shi等人，2024）。甘草苷（Gy）是從甘草根（Glycyrrhiza glabra）中提取的天然三萜皂苷，具有典型的兩親結構，包含疏水的甘草酸苷元和親水的葡萄糖醛酸二糖鏈，能夠在油水界面有效吸附（Rai等人，2021；Taarji等人，2021）。
基于對pH敏感的相互作用已有理解，我們假設酸性pH值作為α-La-Gy系統的精確“分子觸發器”。然而，關于酸性pH值（從溫和到極端）如何精確調節α-La與Gy之間的相互作用、由此產生的構象動態以及與宏觀乳液穩定性的因果關系，目前仍知之甚少。此外，關于這種pH定制復合物的界面行為的原子級見解仍然缺乏。因此，闡明這種pH依賴機制對于合理設計基于蛋白質-皂苷的乳化劑至關重要。分子動力學（MD）模擬是一種強大的工具，可以原子級別研究此類界面現象和分子相互作用，已廣泛應用于研究蛋白質折疊、表面活性劑吸附和界面上的生物分子行為（Goodarzi和Zendehboudi，2019；Jia等人，2024；Munusamy等人，2018）。最近的研究利用MD模擬成功研究了卵白蛋白在空氣-水界面的吸附（Jin等人，2022）、甘油酸在zein-Tween20穩定乳液中的分布（Chen、Wang和Xiao，2024），以及hydrophobin在油/水界面的取向和構象變化（Yu等人，2022），顯示出其在提供補充機制見解方面的潛力。
本研究的主要目標是通過結合多尺度實驗技術和計算模擬，系統地揭示酸性pH驅動的α-La與Gy相互作用及其對乳液穩定性的影響機制。通過將分子層面的結構變化與宏觀功能聯系起來，本研究旨在為穩定、天然的乳液系統的合理設計提供基本見解。理解這一機制對于開發清潔標簽的乳制品配方至關重要，特別是對于穩定酸化的乳清飲料、酸奶奶昔及相關乳液，從而擴展乳清蛋白的應用范圍。
材料
來自牛乳的α-La粉末（≥85%）購自Sigma-Aldrich公司（美國密蘇里州圣路易斯）。Gy（≥99%）購自上海Macklin生化技術有限公司（中國上海）。8-苯胺萘-1-磺酸（ANS）也購自Sigma-Aldrich公司。所有其他使用的化學品均為分析級。
在不同pH值下形成的α-La-Gy復合物的制備和表征
在蒸餾水中制備了α-La溶液（5 mg/mL和2 mg/mL）和Gy溶液（5 mg/mL）。將α-La溶液的pH值調整至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0
粒徑和ζ電位
粒徑是評估分散系統穩定性的重要指標（Sun等人，2022）。圖1a和b顯示了pH值對含Gy或不含Gy的α-La粒徑分布的影響。在pH 3.0和2.0時，α-La的粒徑分布更均勻，而在pH 5.0和4.0時分布更寬。在pH 5.0和4.0時，加入Gy導致粒徑增大，平均粒徑顯著增加（圖1c），這歸因于靜電排斥力的減弱
結論
總之，本研究系統地證明了酸性pH值是增強α-La與Gy相互作用的有效策略，從而形成了具有優異乳化性能的復合物。在極端酸性條件（pH 2.0–3.0）下，α-La的結構展開暴露了疏水區域，增加了溶劑的可及性，促進了通過疏水作用和氫鍵作用與Gy的更強結合。這些分子層面的變化
CRediT作者貢獻聲明
史瑞杰：撰寫 – 原稿撰寫、軟件使用、方法設計、實驗研究、概念構建。高增利：實驗研究、數據分析。穆志深：撰寫 – 審稿與編輯、監督。元麗霞：實驗研究。李寧：數據管理。江占梅：撰寫 – 審稿與編輯、監督
未引用參考文獻
Cornacchia等人，2014；Homeyer和Gohlke，2012；Li等人，2022；Shi等人，2024。
利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了中國博士后科學基金會（項目編號：2023M741834）和聊城大學的博士研究項目（項目編號：318052261）的支持。
