《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Synthetic transactivator–promoter systems for exogenous gene expression in
Chlamydomonas reinhardtii
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藍藻作為生物柴油和高端生物分子的可持續生產資源，本研究構建了基于四環素抑制蛋白（TetR）的合成轉錄激活系統（TetR-VP192），通過瞬時表達平臺篩選出VP192激活域，其與TetR或反向TetR結合可實現劑量依賴性基因表達調控。與TRE-HSP70A融合后，轉基因表達量較傳統HSP70A/RbcS2雜合啟動子提升14倍以上。
川邊良典（Yoshinori Kawabe）| 秋山龍樹（Tatsuki Akiyama）| 宮澤心（Kokoro Miyazoe）| 上平雅道（Masamichi Kamihira）
九州大學工學部化學工程系，日本福岡市西區本岡744，郵編819-0395
萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一種單細胞光合真核生物，長期以來一直作為基礎生物學研究和生物技術應用的模式微藻。近年來，它因作為可持續生產生物油和高價值生物分子的潛在生物資源而受到關注。為了提高該物種的生物技術應用價值，近年來開發了多種基因工程工具。在這項研究中，我們將廣泛用于哺乳動物和其他真核細胞的四環素抑制因子（TetR）轉激活系統重新改造，用于建立一種在萊茵衣藻中外源基因表達的合成轉錄激活系統。我們首先構建了一個基于瞬時表達的評估平臺，以篩選在萊茵衣藻中具有功能的轉錄激活域（TADs）。在分析的TADs中，VP192（由12個VP16核心結構域串聯重復組成）與TetR或Gal4 DNA結合域融合時表現出最高的轉錄活性。此外，包含VP192與TetR或反向TetR的融合蛋白能夠以劑量依賴的方式調控轉基因的表達，且這種調控依賴于多西環素。值得注意的是，即使將四環素響應元件（TRE）與HSP70A啟動子融合，轉錄誘導性仍然得以保持。將TetR-VP192與這種合成嵌合啟動子（TRE-PHSP）結合后，轉基因的表達水平比強效的HSP70A/RbcS2雜交啟動子高出14倍以上。這些發現表明，人工轉錄因子和工程化啟動子為調控萊茵衣藻中外源基因表達提供了多功能分子工具箱。
部分內容摘錄
細胞與培養基
萊茵衣藻菌株Chlamy/S（23）是由缺乏細胞壁的C. reinhardtii菌株CC-406（cw15, mt?）通過基因工程改造得到的。細胞在Tris-乙酸-磷酸（TAP）培養基（24）中，在帶有0.22微米通氣孔的T-25培養瓶（VTC-F25V；As One，大阪，日本）中混合營養條件下進行培養。培養在室溫下的旋轉搖床（50 rpm；Wave-SI，型號0054334-000；Taitec，埼玉，日本）上進行，光照周期為16小時/黑暗8小時，且持續基于瞬時轉染的評估系統
在萊茵衣藻中，外源基因的表達受由調控元件（包括啟動子、非翻譯區和內含子）組成的表達單元控制。傳統上，轉基因表達水平的評估依賴于穩定轉化體，但這種方法常常受到克隆間變異性的限制，需要篩選大量獨立克隆。此外，菌落形成所需的時間較長，導致這一過程勞動強度大且效率低下
CRediT作者貢獻聲明
川邊良典：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿，數據可視化，項目監督，資源協調，方法設計，資金獲取，數據分析，概念構建。秋山龍樹：實驗研究，數據分析。宮澤心：實驗研究，數據分析。上平雅道：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿，數據可視化，結果驗證，項目監督，資源協調，方法設計，數據管理，
致謝
本工作得到了日本學術振興會（JSPS KAKENHI）項目（項目編號JP20K05233）以及中村治郎醫學財團（Nakamura Jishiro Ikueikai Foundation）和高橋產業經濟研究基金會（Takahashi Industrial and Economic Research Foundation）（項目編號14-003-382）的資助。感謝Edanz對本手稿草稿的編輯工作。
