膠原蛋白是哺乳動物體內最重要且最豐富的蛋白質之一，約占總蛋白質的30%（Aguirre-Cruz等人，2020年）。膠原蛋白由三條肽鏈纏繞形成三螺旋構象，為許多器官提供抗拉強度和結構支持，并參與調節細胞黏附、增殖、遷移和分化（Wang等人，2023年）。作為一種天然結構蛋白，膠原蛋白的多功能性、生物相容性和低免疫原性極大地推動了其在生物醫學領域的應用發展，例如用于促進傷口愈合的生物相容性敷料、控釋藥物輸送系統、減少免疫反應的支架或組織植入物，以及相關器官的培養（Fertala等人，2020年；Xu等人，2021年；Malcor和Mallein-Gerin，2022年；Amirrah等人，2022年；Nguyen等人，2023年）。

天然膠原蛋白是一種不溶性纖維蛋白，其分子序列包含獨特的重復序列(Gly-X-Y)n，在合成過程中需要經過嚴格的翻譯后修飾和復雜的自我組裝過程，因此存在表達困難、表達水平低、分泌困難以及純化復雜等問題（Brodsky和Ramshaw，2017年）。通過重組表達制備的膠原蛋白具有分子量均勻、純度高且無病毒傳播隱患的優點。但在大規模生產過程中，確保其完全的三螺旋結構一直是一個技術難題（Fu等人，2022年）。具體而言，膠原蛋白三螺旋結構的技術瓶頸主要在于修飾過程（恢復膠原蛋白的二級或更高層次的結構），難點在于基因片段的選取和三螺旋結構的穩定性（Ito和Nagata，2021年）。

早期研究主要集中在通過基因工程技術優化膠原蛋白的編碼序列以適應不同的宿主系統。例如，侯增淼等人發現特定的密碼子優化可以顯著提高重組蛋白的表達水平。這種優化不僅解決了異源基因被宿主細胞識別的問題，還提高了翻譯效率（Hou等人，2019a）。隨著研究的深入，科學家們開始探索更復雜的分子修飾方法，如糖基化、磷酸化、羥基化等翻譯后修飾。4-羥基脯氨酸殘基在膠原蛋白合成過程中對維持三螺旋結構及其生物特性起著重要作用（Abraham等人，2021年）。一些原核表達系統由于缺乏脯氨酰4-羥化酶（P4H）而無法對膠原蛋白中的脯氨酸殘基進行羥基化。多年來，已經開發出多種重組表達系統來表達重組膠原蛋白，如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母和大腸桿菌（Olsen等人，1991年；Zhang等人，2009年；Gellermann等人，2019年；Rutschmann等人，2014年）。重組膠原蛋白的氨基酸序列通常由片段組成而非全長序列，這限制了其應用范圍。此外，由于許多重組膠原蛋白缺乏必要的羥基化修飾，導致其獨特的三螺旋結構無法形成或不穩定（Krieglstein等人，2002年；Fallas等人，2010年）。具有P4H的哺乳動物細胞，如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞和HEK293細胞，可以通過翻譯后修飾直接產生羥基化膠原蛋白。CHO細胞具有較高的懸浮密度，產生的重組蛋白具有類似于人源化蛋白的翻譯后修飾特性，因此適合作為重組膠原蛋白生產的宿主（Geng等人，2024年）。哺乳動物細胞表達系統具有相對完整的轉錄修飾系統，適合表達重組膠原蛋白。然而，由于表達水平的限制，重組膠原蛋白在哺乳動物細胞中的性質研究較少。已有研究表明，CHO細胞可用于表達全長人I型膠原蛋白α1鏈（rhCOL1α1），并證明了其能夠自組裝成纖維并促進3T3細胞的增殖和遷移（Wang等人，2024年）。

PB轉座子是一種能夠插入和刪除特定基因序列的DNA元件。它不僅可以在基因組內部轉座，還可以在不同基因組之間轉座。通過提高轉座率，可以增加目標基因的拷貝數，從而提高蛋白質表達（Tsai等人，2022年；Chen等人，2010年；Wei等人，2022年）。一些研究表明，PB轉座子具有較高的整合效率，可以定點整合到基因組的活躍轉錄區域，顯著提高基因轉移效率和表達穩定性，可用于高效生產高質量的治療性蛋白質（Rajendra等人，2017年；Matasci等人，2011年）。

目前，rhCOL3A1主要以小片段形式表達，因為其全長表達需要脯氨酸殘基的羥基化。為了有效生產穩定的rhCOL3A1，選擇CHO細胞作為宿主細胞表達全長和截短形式的III型膠原蛋白，并利用PB轉座子系統來提高重組人III型膠原蛋白在CHO細胞中的外源表達。通過工藝優化進一步改善了重組膠原蛋白的表達，并對其結構進行了表征，評估了其抗氧化活性和促進細胞增殖的能力，為其在食品、化妝品和醫療行業的應用提供了理論基礎。

CHO-S細胞分別單獨轉染了pCOL3A1-1和pCOL3A1-2載體，以及以9:1的比例同時轉染了pPB-COL3A1-1和pPB-COL3A1-2載體及PBase轉座酶載體。經過壓力篩選后獲得了細胞池，其中pCOL3A1-1和pCOL3A1-2作為對照組，pPB-COL3A1-1和pPB-COL3A1-2作為實驗組。懸浮培養7天后，收集上清液進行Western blot（WB）分析。如圖1的WB圖表所示，與對照組相比...

本研究探討了利用PB轉座子系統在CHO細胞中生產具有天然三螺旋結構的重組人III型膠原蛋白的策略。PiggyBac轉座子系統使重組人III型膠原蛋白rhCOL3A1-1和rhCOL3A1-2在CHO細胞中的表達水平分別提高了7.66倍和4.2倍（圖1）。與傳統質粒的隨機整合相比，PB轉座子的“剪切-粘貼”機制顯著提高了外源基因的整合效率...

王婷瑜和孫秋麗設計了實驗。羅聰慧和孫秋麗進行了實驗操作。王婷瑜、景長琴、孫秋麗、梁俊豪和羅聰慧共同起草了論文。王婷瑜提供了試劑和材料。所有作者均審閱并批準了最終稿件。

本研究得到了國家自然科學基金（項目編號：U23A20270）、省級科技研發計劃聯合基金（235101610005）、河南省自然科學基金（252300421678）以及新鄉醫學院博士科研基金（XYBSKYZZ202162）的支持。

作者聲明不存在可能影響本文工作的已知財務利益沖突或個人關系。