《Journal of Chromatography A》：Integrating natural deep eutectic solvents and ionic liquids as green mobile phase additives for enhanced selenium speciation analysis in food samples by liquid chromatography–atomic fluorescence spectrometry
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該研究首次將基于膽堿鹽（ChCl）的天然深共熔溶劑（NADES）與咪唑類離子液體（IL）結合用于高效液相色譜（RP-HPLC）分離硒（Se）物種，并驗證了其與氫化物發生-原子熒光光譜（HG-AFS）聯用的檢測效能。通過優化NADES組成（ChCl:EG和ChCl:Gly）、濃度及與IL的協同作用，實現了無機硒（Se(IV)/Se(VI)）和有機硒（SeMet/SeMetSeCys）的基線分離，檢測限達1.59-2.78 μg L?1，方法成功應用于復雜食物樣本分析，回收率93.4%-106%。
瑪麗亞·B·博特拉（María B. Botella）| 瑪麗亞·N·奧維耶多（María N. Oviedo）| 羅多爾福·G·威盧德（Rodolfo G. Wuilloud）
分析化學實驗室（QUIANID），阿根廷庫約國立大學（Universidad Nacional de Cuyo）精確與自然科學學院（Facultad de Ciencias Exactas y Naturales）/基礎科學跨學科研究所（Instituto Interdisciplinario de Ciencias Básicas，CONICET UNCUYO），帕德雷·J·孔特雷拉斯街1300號（Padre J. Contreras 1300），門多薩（Mendoza），郵編5500
摘要
本研究評估了天然深共晶溶劑（NADES）和離子液體（ILs）對反相高效液相色譜法分離硒（Se）物種的影響，并采用氫化物生成原子熒光光譜法（RP-HPLC-HG-AFS）進行檢測。實驗中使用了氯化膽堿：乙二醇和氯化膽堿：甘油作為流動相添加劑，用于分離Se(IV)、Se(VI)、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeMetSeCys）。系統研究了NADES的組成、摩爾比和濃度對色譜性能的影響，以及pH值、緩沖液強度和流速的作用。將NADES與離子液體1-己基-3-甲基咪唑鎓氯化物（[C6mim]Cl）結合使用后，顯著提高了無機硒物種的分辨率。此外，還利用多元統計技術研究了NADES和ILs對HG-AFS檢測信號的影響，以優化靈敏度。該方法實現了1.59-2.78 μg L-1的檢測限，保留時間的相對標準偏差為0.53-1.86%，峰面積的相對標準偏差為1.23-1.72%。最后，該方法成功應用于復雜食品樣品（包括堅果和富硒大蒜）中的硒物種分析，回收率在93.4-106%之間。
引言
硒（Se）是一種微量營養素，對多種生理功能至關重要，包括抗氧化防御和免疫反應。然而，其安全攝入范圍與毒性之間的差距非常狹窄，過量攝入可能導致嚴重的健康問題[1]。因此，評估人體暴露情況至關重要，尤其是考慮到飲食是硒的主要來源。硒在食品中的毒性、生物利用度和反應性取決于其化學形式和濃度。通常，有機硒物種（如硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeCys）的生物利用度高于無機形式[2]。此外，Se(IV)的毒性高于Se(VI)，主要是因為其代謝速度更快且生物利用度更高[1]。因此，需要能夠區分不同硒物種的分析方法，以獲得有關營養價值和毒理學風險的有意義信息。
硒物種分析需要靈敏的檢測技術和高效的分離技術。常用的技術是將高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）或原子熒光光譜（AFS）結合使用[3]。HPLC特別適合分離無機和有機硒物種，包括Se(IV)、Se(VI)、硒代氨基酸和硒蛋白[4]。與AFS結合的氫化物生成（HG）技術因其選擇性高、靈敏度高和操作成本低而得到廣泛應用[5]。因此，使用HPLC-AFS可以實現出色的檢測限（LODs），從而進行精確的硒物種分析[5]。
在文獻中報道的多種色譜技術中，反相（RP）色譜法和陰離子交換色譜法（AEC）是最常用的硒物種分析方法[4]。在RP-HPLC中，通常使用含有少量有機改性劑（如甲醇（MeOH）或乙腈）的水基流動相。但由于這些溶劑的揮發性和毒性，近年來的研究重點在于開發更環保的流動相。此外，三氟乙酸（TFA）和七氟丁酸（HFBA）等離子對試劑也被用作流動相添加劑，以增加保留時間和分辨率，但它們往往會延長分離時間。盡管這些試劑具有很強的離子對能力，仍無法完全分離無機硒物種[6]。因此，人們探索了新的流動相添加劑，包括離子液體（ILs）和深共晶溶劑（DESs）[7]。將ILs作為添加劑加入色譜體系中，可以提高峰的對稱性、分辨率，并有效掩蓋游離硅醇基團，同時顯著縮短特定分析物的保留時間[5,6,8]。
與ILs類似，DESs也被用作RP-HPLC的流動相添加劑，主要通過有效抑制峰尾效應來提高分辨率[9]。DESs通常由兩種組分按特定摩爾比合成：氫鍵供體（HBD）和氫鍵受體（HBA），形成共晶體系，其熔點明顯低于單獨組分[10]。當這些組分來自天然來源（如糖類、氨基酸或有機酸）時，所得混合物稱為天然DESs（NADESs）[11]。這些溶劑價格低廉、易于制備、可生物降解，且由生物可代謝的成分組成。基于氯化膽堿（ChCl）和乙二醇（EG）的NADESs作為流動相添加劑，可改善HPLC分析效果，產生形狀清晰、峰尾效應小的色譜峰[12]。因此，將NADESs加入HPLC流動相可帶來多種優勢，包括抑制峰尾效應、提高柱效和縮短保留時間[13]。盡管如此，NADESs此前尚未用于硒物種分析。
本研究探討了基于ChCl的NADESs作為RP-HPLC流動相添加劑在分離Se(IV)、Se(VI)、SeMet和硒代半胱氨酸（SeMetSeCys）中的應用。系統評估了NADES的組成、摩爾比和濃度，以及pH值、緩沖液強度和流速對色譜性能的影響。研究了NADES與咪唑鎓基ILs的協同作用，以提高分離效率，并探討了這些溶劑對HG-AFS檢測信號的影響。該方法成功應用于復雜食品樣品（包括堅果和富硒大蒜）的分析，顯示出良好的分析潛力。該方法利用NADESs和ILs作為流動相添加劑，實現了更環保的硒物種分析，減少了有毒有機溶劑和氟化離子對試劑的使用，同時保持了高色譜效率和與HG-AFS檢測的兼容性。此外，NADESs和ILs的結合使硒物種在短時間內得到完全分離，降低了溶劑消耗。
儀器介紹
儀器
硒物種的色譜分離采用Agilent 1260 Infinity II HPLC系統（美國加利福尼亞州圣克拉拉市）完成，該系統配備四級泵和Agilent Zorbax SB-C8分析柱。用于測定無機和有機硒物種的儀器為Rayleigh AF-640A原子熒光光譜儀（北京瑞利分析儀器有限公司，北京），配備硒空心陰極燈和在線UV光氧化單元。NADESs的表征
NADESs的合成主要基于其組分中的羥基、羰基和羧基等官能團之間的氫鍵相互作用[20]。本研究使用FT-IR光譜分析了ChCl基NADESs中形成共晶的分子間相互作用，其中EG和Gly作為HBD。純組分和NADESs的FT-IR光譜見圖S1。結論
本研究首次將基于ChCl的NADESs作為流動相添加劑用于RP-HPLC分離硒物種。ChCl:EG（1:3）的混合物改善了峰形和分辨率，同時與HG-AFS檢測完全兼容。通過將NADESs與咪唑鎓基ILs結合使用，實現了Se(IV)、Se(VI)、SeMetSeCys和SeMet的完全分離，顯示出明顯的協同效應。這些改進可能歸因于多種分離機制。
作者貢獻聲明
瑪麗亞·B·博特拉（María B. Botella）：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、方法學設計、實驗研究、數據分析、概念構建。瑪麗亞·N·奧維耶多（María N. Oviedo）：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、方法學設計、實驗研究、概念構建。羅多爾�！·威盧德（Rodolfo G. Wuilloud）：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、項目監督、資源管理、項目實施、方法學設計、實驗研究、資金申請。利益沖突聲明
作者聲明沒有可能影響本文研究的已知財務利益或個人關系。致謝
本研究得到了阿根廷國家科學技術研究委員會（CONICET，項目編號PUE和PIP 0143）和庫約國立大學（項目編號06/80020240100649UN）的支持。
