《Journal of Controlled Release》：Prophylactic sequential drug administration potentiates cancer radiotherapy by inhibiting cholesterol deposition and cellular senescence
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本研究針對放療誘導的腫瘤自適應抵抗問題，設計了一種納米藥物U@HC通過分步釋放U18666A和β-環糊精抑制溶酶體膽固醇異常沉積及細胞衰老，增強放療敏感性并延長小鼠生存，為克服放療抵抗提供新策略。
作者：郎珊珊、楊旭璐、趙欣、董安琪、劉同同、劉騰、楊凱
單位：中國江蘇省蘇州市蘇州醫科大學放射醫學與防護學院暨放射科學與交叉學科學院（RAD-X）附屬第一醫院病理科，江蘇省輻射醫學與防護重點實驗室，江蘇省高等教育機構輻射醫學協同創新中心，江蘇省腫瘤研究所，郵編215123
摘要
放療是主要的癌癥治療手段，但電離輻射（IR）引發的適應性抵抗會降低治療效果。在導致放療抵抗的各種因素中，溶酶體膽固醇沉積和細胞衰老之間存在復雜的相互關系，其機制尚不明確，相應的解決方案也不夠完善。本研究評估了電離輻射引起的癌細胞變化，這些變化導致了放療抵抗，為開發能夠逐步釋放藥物的納米藥物（U@HC）提供了依據，從而增強放療效果。U@HC利用腫瘤內的酸性環境和高水平的谷胱甘肽，依次釋放U18666A和β-環糊精。預處理使用U@HC可以抑制放療過程中癌細胞中溶酶體膽固醇的異常積累，同時減少細胞衰老和衰老相關的分泌表型，從而顯著提高放療敏感性，延長小鼠的生存期。本研究提出了一種通過調節溶酶體膽固醇來緩解細胞衰老的新策略，為克服放療抵抗和提高癌癥放療效果提供了具有臨床前景的方法。
引言
放療利用高能射線直接損傷染色體DNA和/或產生活性氧（ROS）來殺死快速增殖的癌細胞，在臨床上被廣泛用于抑制局部腫瘤[1]。然而，除了腫瘤本身的特性（如缺氧和癌干細胞）會降低放療效果外，最近的研究發現電離輻射（IR）總會引發腫瘤的適應性自我保護反應，導致放療抵抗[2]。例如，放療過程中的DNA損傷會啟動修復途徑[3]，氧化應激會激活抗氧化系統并刺激自噬以清除自由基和細胞碎片[4]。PI3K/AKT/mTOR和NF-κB等生存信號通路會被激活，抑制細胞凋亡并加速損傷修復[5][6]。此外，放療還會誘導上皮-間質轉化（EMT），進一步增強細胞的遷移和生存能力[7]。因此，深入理解適應性放療抵抗的機制和相互作用對于開發新的放療策略以改善治療效果和患者預后至關重要。
細胞衰老是一種由復制耗竭或各種應激因素引發的永久性細胞周期停滯狀態，可能會破壞組織穩態并促進病理變化[8]。在癌癥放療過程中，電離輻射引起的DNA斷裂和氧化應激會觸發衰老基因的表達，激活癌細胞的衰老信號通路，導致細胞周期停滯，為DNA損傷修復提供時間[9][10]。此外，衰老的癌細胞會分泌衰老相關分泌表型（SASP）因子，包括白細胞介素-6（IL-6）、CCL5趨化因子配體5和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），這些因子會促進腫瘤增殖、重塑細胞外基質、加速血管生成并增強免疫逃逸，從而促進腫瘤的侵襲性和生存能力[11][12]。為了消除細胞衰老，最近的研究提出了多種策略，包括使用天然抗衰老產物（如槲皮素）通過抑制Bcl-2/Bax比率來抑制腫瘤增殖[13]，使用senolytics（如ABT 263）清除衰老細胞并防止腫瘤生長[14]，以及使用senomorphics（如mTOR抑制劑雷帕霉素[15]或STING抑制劑H-151[16]）來抑制SASP。盡管這些藥物在體外研究中表現出一定效果，但它們主要針對衰老的下游因素，但仍面臨適應性抵抗、腫瘤內積累不足、脫靶效應以及未能緩解甚至加劇腫瘤免疫抑制等問題。因此，研究衰老的成因并開發針對關鍵節點的納米藥物以從源頭上抑制細胞衰老至關重要。
癌細胞為了生存和損傷修復，總會進行適應性代謝重編程[17][18]。最新研究表明，放療會促使癌細胞重新編程其代謝途徑，如糖酵解和戊糖磷酸途徑、氧化還原代謝以及大分子修復[19]。在這些代謝變化中，膽固醇代謝起著關鍵作用[20]。膽固醇作為細胞的關鍵營養物質，廣泛分布于細胞膜和細胞器中，可以調節膜流動性和細胞生長與增殖的信號通路[21]。在應激條件下，癌細胞會同時上調SREBP2以增強內源性膽固醇合成，并增加低密度脂蛋白受體（LDLR）的水平以促進外源性膽固醇的攝取[22][23]。這種膽固醇代謝重編程有助于修復受損的膜和脂質筏，從而降低治療效果[24]。先前的研究表明，降膽固醇藥物（如他汀類藥物）可以適度改善癌癥治療效果[25][26]。然而，全身性的膽固醇降低常常會觸發補償性反饋機制，使膽固醇水平恢復[27]，因此需要開發能夠精確、局部調節膽固醇的策略，并與其他治療手段結合使用。
溶酶體是膽固醇代謝和細胞穩態的核心樞紐[28]。無論是新合成的膽固醇還是內吞的脂蛋白，都在溶酶體內被處理，隨后水解為游離膽固醇并分布到各個細胞區室[29][30]。盡管膽固醇的細胞內分布對腫瘤增殖和治療抵抗至關重要，但針對放療后膽固醇失調的代謝策略卻很少。最新研究表明，促進衰老的信號會促進溶酶體膽固醇的積累，進而通過促進SASP維持衰老表型[31]。因此，進一步探討放療后膽固醇代謝重編程與放療誘導的細胞衰老之間的關系可能是從根本上解決放療抵抗的關鍵。因此，開發靶向腫瘤的納米藥物以通過防止溶酶體膽固醇過載來緩解細胞衰老，在克服放療抵抗方面具有巨大潛力，可能顯著提高腫瘤對放療的敏感性。
為了解決電離輻射引起的膽固醇代謝改變和細胞衰老相關的適應性抵抗，我們設計了一種新型納米藥物（U@HC NPs），該藥物能夠在腫瘤中依次釋放藥物，從而預防性地增強放療效果（圖1）。首先，評估了X射線照射對癌細胞的影響，重點關注膽固醇的水平、分布和變化機制以及細胞衰老的特征。接下來，測試了放療前使用U18666A和β-環糊精（βCD）等自由藥物對細胞膽固醇和衰老的調節作用，以優化給藥順序，并通過蛋白質組學分析揭示了順序給藥的安全性機制。此外，還設計了U@HC NPs，以實現腫瘤靶向和刺激響應性的U18666A和βCD的順序釋放體內。在X射線照射前給予U@HC NPs可有效抑制腫瘤生長并延長小鼠生存期，這歸因于防止了膽固醇沉積和細胞衰老以及促進了腫瘤中的T細胞功能。我們的發現表明，通過U@HC NPs的順序給藥預防膽固醇過載和細胞衰老，可以防止適應性抵抗，為提高臨床癌癥放療效果提供了有前景的策略。
總膽固醇和游離膽固醇的定量測定
3T3、HIEC和Hepa細胞分別接種在6孔板中（每孔5×10^4個細胞），培養24小時后暴露于X射線照射。72小時后，這些細胞被裂解，使用總膽固醇測定試劑盒和游離膽固醇測定試劑盒進行檢測，通過BioTek板讀數儀測量550nm處的吸光度。同時，使用BCA蛋白測定試劑盒測量細胞蛋白含量，通過BioTek板讀數儀測量562nm處的吸光度。
通過抑制NPC1和NPC2來抑制電離輻射引起的溶酶體膽固醇沉積
考慮到游離膽固醇對膽固醇合成和攝取的反饋控制至關重要，我們首先測量了接受或不接受8Gy X射線照射的各種細胞中的游離膽固醇含量。結果顯示，3T3和HIEC正常細胞的游離膽固醇含量僅略有上升（圖2a），而CT26和Hepa癌細胞的游離膽固醇含量顯著增加（圖2b）。在處理過的細胞中也觀察到了同樣的趨勢。
討論
電離輻射（IR）引發的適應性抵抗疊加了腫瘤的固有特性，對有效的癌癥放療非常不利。最近的研究集中在研究導致放療抵抗的因素上，其中膽固醇重編程和細胞衰老的相關機制尚不明確，相應的解決方案也不夠完善。傳統上，要么在放療后給予調節膽固醇代謝的藥物，要么使用senolytics
CRediT作者貢獻聲明
郎珊珊：撰寫——原始稿件、可視化、項目管理、研究。
楊旭璐：可視化、驗證、項目管理、研究。
趙欣：項目管理、研究。
董安琪：驗證、研究。
劉同同：可視化、研究。
劉騰：撰寫——審稿與編輯、撰寫——原始稿件、資金獲取、概念構思。
楊凱：撰寫——審稿與編輯、監督、資金獲取、概念構思。
資助
本研究部分得到了國家自然科學基金（32171382, 32471443）、江蘇省社會發展重點研發計劃（BE2022725）、江蘇省高等教育機構自然科學基金（24KJB310017）、江蘇省第七批333高層次（第二層次）人才項目、蘇州市基礎研究項目（SJC2023001）以及蘇州醫科大學跨學科基礎前沿創新計劃的支持
