《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Interplay Between 7-Ketocholesterol and Tamoxifen Shapes Stress Responses in Breast Cancer Cells
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乳腺癌細胞對7-酮膽固醇和他莫昔芬的協同應激反應研究，發現MCF-7和BT-20細胞通過代謝重編程與炎癥應答分別適應或崩潰，ST8SIA6基因關聯應激耐受。
Karolina Seborova|Kamila Koucka|Tereza Tesarova|Michaela Kurucova|Marie Ehrlichova|Petr Holy|Viktor Hlavac|Pavel Soucek|Alzbeta Spalenkova
藥理基因組學實驗室，比爾森查爾斯大學醫學院生物醫學中心，捷克共和國比爾森323 000
摘要
7-酮膽固醇（7-KC）是一種含量豐富且具有生物活性的脂質氧化產物，它會破壞膜完整性、固醇穩態、線粒體功能以及氧化還原平衡。與此同時，他莫昔芬作為雌激素受體陽性乳腺癌的主要治療藥物，不僅能夠拮抗雌激素受體，還會引發顯著的代謝和細胞器相關應激。在本研究中，我們探討了乳腺癌細胞系模型對他莫昔芬、7-KC及其聯合使用的轉錄反應。
他莫昔芬在MCF-7和BT-20細胞中均引發了共同的抗增殖反應，表現為細胞周期進展、DNA復制和有絲分裂的抑制。然而，這兩種細胞模型中的下游應激反應存在顯著差異：MCF-7細胞激活了適應性反應機制，包括未折疊蛋白反應、自噬以及向糖酵解方向的代謝重編程，這與細胞停滯存活狀態一致；而BT-20細胞則表現出代謝和氧化還原途徑的抑制，并伴有炎癥和凋亡信號通路激活，表明其應激適應能力受損。他莫昔芬與7-KC的聯合處理進一步加劇了這些不同的應激反應表型。
通過對16個表達相反方向的基因與乳腺癌患者臨床數據的相關性分析，證實ST8SIA6是介導適應性應激耐受性的主要候選基因。總體而言，我們的研究結果表明，細胞整合代謝和氧化還原應激的能力決定了乳腺癌細胞對內分泌和他莫昔芬聯合誘導的應激的具體反應。
引言
7-酮膽固醇（7-KC）是通過非酶促氧化膽固醇生成的最豐富且生物活性最強的氧化甾醇之一。在氧化應激、慢性炎癥和脂質代謝紊亂的情況下，7-KC會大量積累，并與多種疾病（包括動脈粥樣硬化、神經退行性和癌癥）的發病機制有關[1], [2]。在細胞水平上，7-KC會嚴重破壞膜完整性、固醇穩態和線粒體功能，從而成為強烈的代謝和結構應激源。
在乳腺癌中，膽固醇代謝和氧化甾醇信號通路的改變被認為是腫瘤進展和治療反應的重要因素[3]，因為膽固醇衍生的氧化甾醇能夠調節雌激素受體（ER）信號通路，促進腫瘤生長和轉移[4]。尤其是ER陽性的（ER+）乳腺癌細胞，其對脂質調控信號通路的依賴性更強，這些通路協調細胞增殖、膜組織結構和激素受體活性，因此細胞脂質穩態的紊亂會影響細胞對內分泌治療的敏感性和耐藥性[5], [6]。他莫昔芬作為一種選擇性的ER調節劑，仍是ER+乳腺癌治療的基石；然而，內在性和獲得性的耐藥性限制了其長期臨床療效[7]。除了作為ER拮抗劑的作用外，他莫昔芬還會引發線粒體功能障礙、代謝應激以及蛋白質合成和折疊機制的應激，激活未折疊蛋白反應（UPR）和自噬通路[8], [9]。因此，細胞對他莫昔芬的反應越來越反映癌細胞應對治療誘導的應激的整體能力，而不僅僅是ER信號通路的作用。
氧化甾醇可能在內分泌治療的背景下影響這些細胞過程。多項研究表明，氧化甾醇會影響與乳腺癌侵襲性和內分泌敏感性相關的通路；然而，7-KC對他莫昔芬反應和耐藥性的具體貢獻尚未得到充分研究。盡管7-KC不被視為典型的ER配體，但在實驗系統中觀察到了其微弱的雌激素活性，這提示它可能在ER相關信號通路中起調節作用[10]。與此觀點一致，7-KC也被證實能夠調節抗癌治療的療效，這一點在我們最近的綜述中有所總結[3]。
我們之前的研究直接證明了調節7-KC水平可以顯著改變乳腺癌細胞對他莫昔芬治療的反應[11]。我們發現7-KC可以增強或減弱他莫昔芬的細胞毒性作用，這種作用具有細胞類型依賴性，這突顯了膽固醇氧化與內分泌治療療效之間的功能聯系。基于這些觀察結果，本研究旨在闡明7-KC和他莫昔芬在乳腺癌模型中的相互作用機制。為此，我們使用RNA測序技術系統地捕捉了7-KC、他莫昔芬及其聯合使用所誘導的轉錄程序。通過比較治療特異性和細胞環境依賴性的轉錄反應，我們試圖確定聯合脂質相關應激和內分泌應激是促進細胞適應性存活還是導致功能崩潰。這種綜合方法為理解7-KC如何重塑與抗癌治療反應相關的轉錄景觀提供了新的見解。
材料
他莫昔芬（TAM）購自Sigma-Aldrich（美國密蘇里州圣路易斯），7-KC購自Avanti Polar Lipids（美國阿拉巴馬州阿拉巴斯特）。對于體外實驗，TAM和7-KC被溶解后用無水乙醇進一步稀釋。所有其他試劑均為分析級，按收到時的狀態使用。
細胞培養
本研究使用了三種人類乳腺癌細胞系：兩種ER陽性（ER+；MCF-7和T47D）和一種ER陰性（ER-；BT-20）。所有細胞系均購自CLS（德國埃佩爾海姆）。
7-KC和他莫昔芬處理后乳腺癌細胞系的總體轉錄組特征
我們對三種不同的乳腺癌細胞系（ER+和孕酮受體（PR）陽性細胞系MCF-7和T47D，以及ER-和PR陰性細胞系BT-20）進行了mRNA測序（mRNA-Seq），這些細胞系分別接受了7-KC、他莫昔芬或其聯合處理。
首先，我們使用主成分分析（PCA）對所有樣本進行聚類，然后根據細胞系類型對PCA結果進行分層（補充圖S1A）。進一步的分層聚類顯示了ER和PR表達的差異（補充圖S1B）。
討論
本研究深入探討了他莫昔芬、7-KC及其聯合使用在體外乳腺癌模型中的細胞系特異性效應。與之前的觀察結果一致，T47D細胞對7-KC和他莫昔芬+7-KC處理的轉錄反應非常微弱，未檢測到顯著的通路級變化，基因失調也非常少。因此，后續的通路級分析主要集中在MCF-7和BT-20細胞上，這兩種細胞表現出明顯的應激反應。
CRediT作者貢獻聲明
Pavel Soucek：撰寫——審稿與編輯、監督、資源管理、項目協調、資金獲取、概念構思。Karolina Seborova：撰寫——初稿撰寫、軟件使用、方法學設計、實驗實施、數據整理、概念構思。Alzbeta Spalenkova：撰寫——初稿撰寫、數據可視化、結果驗證、項目協調、方法學設計、實驗實施、資金獲取、數據整理、概念構思。Ehrlichová Marie：撰寫——審稿與編輯
寫作過程中生成式AI和AI輔助技術的聲明
在準備本手稿的過程中，作者使用了生成式AI工具（ChatGPT、OpenAI）來輔助語言編輯、提高文本的清晰度和可讀性，并根據作者提供的數據幫助構建和優化科學論點。AI工具還用于輔助結果的解釋和討論內容的連貫性。所有AI輔助的內容都經過了作者的嚴格審查、編輯和驗證。
利益聲明
作者聲明沒有可能影響本文研究結果的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了查爾斯大學資助機構（項目編號164323，資助對象K.K.）、捷克衛生部（與捷克健康研究委員會合作，項目編號NU22-08-00281，資助對象K.S.和V.H.）、以及“比爾森大都會區生物醫學研究與醫療保健整合”項目（項目編號CZ.02.01.01/00/23_021/0008828，歐盟和捷克國家預算共同資助，資助對象P.S.）的支持。
