《Kidney International》：Increased Smoothened signaling promotes kidney fibrosis through inhibiting autophagy in fibroblasts
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本研究為靶向治療慢性腎臟病(CKD)提供了新策略。針對(duì)腎臟纖維化中成纖維細(xì)胞活化機(jī)制不清、有效藥物匱乏的困境，研究人員聚焦Smo(Smoothened)信號(hào)通路，深入探索了其在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在CKD中，成纖維細(xì)胞Smo表達(dá)上調(diào)，通過(guò)激活β-arrestin 1/Src/β-catenin/mTOR通路抑制自噬，從而驅(qū)動(dòng)肌成纖維細(xì)胞活化與腎臟纖維化。靶向敲除成纖維細(xì)胞Smo或β-catenin，或使用Smo特異性拮抗劑NVP-LDE225，可有效恢復(fù)自噬功能、緩解纖維化。該研究揭示了Smo信號(hào)調(diào)控成纖維細(xì)胞自噬缺陷的新機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)纖維細(xì)胞Smo的自噬靶向療法治療CKD提供了創(chuàng)新思路。
慢性腎臟病（CKD）如同腎臟的“無(wú)聲殺手”，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和患病率不斷攀升，給公共衛(wèi)生帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。其發(fā)展的共同終點(diǎn)是腎臟纖維化，即正常的腎臟組織被無(wú)功能的疤痕組織（細(xì)胞外基質(zhì)，ECM）所替代，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。在這個(gè)疤痕形成的過(guò)程中，肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是分泌過(guò)量ECM的“罪魁禍?zhǔn)住薄６I臟中的成纖維細(xì)胞，則是肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源之一。因此，阻止成纖維細(xì)胞活化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，是遏制腎臟纖維化、拯救腎功能的關(guān)鍵。然而，目前針對(duì)此過(guò)程的特效藥物（如針對(duì)經(jīng)典促纖維化因子TGF-β的抗體）臨床試驗(yàn)效果不佳，這促使科學(xué)家們必須深入挖掘成纖維細(xì)胞自身內(nèi)部的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)。
先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Sonic hedgehog (Shh)信號(hào)通路的上游配體Shh在腎臟纖維化中起作用，但其下游受體Smoothened (Smo)在成纖維細(xì)胞活化中的具體角色尚不清晰。同時(shí)，自噬——細(xì)胞內(nèi)部的“清潔回收”系統(tǒng)——在肺、心、皮膚等器官的纖維化中被發(fā)現(xiàn)具有清除ECM、抑制肌成纖維細(xì)胞活化的保護(hù)作用，但在腎臟成纖維細(xì)胞中的功能與調(diào)控機(jī)制仍是未解之謎。有趣的是，Shh/Smo信號(hào)在腫瘤發(fā)生等過(guò)程中被報(bào)道可通過(guò)抑制自噬來(lái)加速疾病進(jìn)展。這不禁讓人猜想：在腎臟纖維化中，Smo信號(hào)是否也通過(guò)“關(guān)閉”成纖維細(xì)胞的自噬功能，從而“啟動(dòng)”其向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程序？為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，并為CKD治療尋找新出路，Xiaonan Wang, Ye Liang, Lili Zhou等研究人員在《Kidney International》上發(fā)表了他們的研究成果。
本研究綜合運(yùn)用了多種關(guān)鍵技術(shù)方法。首先，研究者構(gòu)建了單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）、單側(cè)缺血再灌注損傷（UIRI）、5/6腎切除（5/6NX）和阿霉素腎病（ADR）等多種小鼠CKD模型，并分離培養(yǎng)了原代腎臟成纖維細(xì)胞。其次，通過(guò)先進(jìn)的單細(xì)胞核RNA測(cè)序（snRNA-seq）結(jié)合常規(guī)RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，描繪了健康與CKD狀態(tài)下人、鼠腎臟成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。在機(jī)制探索上，利用遺傳學(xué)方法構(gòu)建了成纖維細(xì)胞特異性Smo、β-catenin及ATG5基因敲除小鼠模型，并在細(xì)胞水平進(jìn)行了基因過(guò)表達(dá)、敲低及藥物干預(yù)。此外，通過(guò)透射電鏡觀察自噬小體、免疫熒光檢測(cè)自噬流、蛋白免疫印跡（Western blot）、免疫組化/免疫熒光共定位等技術(shù)，系統(tǒng)評(píng)估了自噬能力與成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)。研究還涉及了染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。在樣本來(lái)源方面，研究使用了來(lái)自花都區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科的CKD患者腎活檢石蠟切片作為人體組織驗(yàn)證。
Smo在活化的腎臟成纖維細(xì)胞中上調(diào)并與自噬功能缺陷相關(guān)
研究人員首先利用人類腎臟單細(xì)胞圖譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在CKD患者的成纖維細(xì)胞亞群（尤其是皮質(zhì)成纖維細(xì)胞、退化性成纖維細(xì)胞和適應(yīng)性成纖維細(xì)胞）中，Smo表達(dá)顯著升高。在多種CKD患者及小鼠模型的腎組織中，Smo在間質(zhì)細(xì)胞（特別是成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞）中的表達(dá)隨疾病進(jìn)展而增加，且與纖維化病變程度正相關(guān)。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析揭示，Smo高表達(dá)的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出顯著降低的自噬評(píng)分和功能。在從纖維化小鼠腎臟分離的原代成纖維細(xì)胞中，Smo表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，自噬流受阻，自噬底物接頭蛋白SQSTM1/p62堆積，且對(duì)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素的反應(yīng)性喪失。這些結(jié)果表明，Smo的上調(diào)與腎臟成纖維細(xì)胞的自噬功能缺陷密切相關(guān)。
Shh/Smo信號(hào)通過(guò)抑制自噬促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化
在體外實(shí)驗(yàn)中，用Shh刺激大鼠腎臟成纖維細(xì)胞系（NRK-49F）或過(guò)表達(dá)Smo，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物（如α-SMA、纖維連接蛋白）表達(dá)上調(diào)，同時(shí)抑制自噬流、增加SQSTM1。而使用特異性Smo拮抗劑NVP-LDE225或自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素處理，則能逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)，恢復(fù)自噬并抑制成纖維細(xì)胞活化。更重要的是，在自噬關(guān)鍵蛋白ATG5敲除的成纖維細(xì)胞中，Shh對(duì)自噬的抑制和對(duì)肌成纖維細(xì)胞活化的促進(jìn)作用被進(jìn)一步增強(qiáng)，這突顯了自噬缺陷是Smo驅(qū)動(dòng)成纖維細(xì)胞活化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
特異性敲除成纖維細(xì)胞Smo可增強(qiáng)自噬并減輕腎纖維化
為了在體內(nèi)驗(yàn)證Smo的作用，研究人員構(gòu)建了成纖維細(xì)胞特異性Smo基因敲除小鼠（SmoCKO）。在UUO模型中，與對(duì)照小鼠相比，SmoCKO小鼠腎臟成纖維細(xì)胞的自噬能力得到顯著恢復(fù)（表現(xiàn)為自噬小體增多、LC3B-II形成增加、SQSTM1減少），同時(shí)肌成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物表達(dá)下降，腎臟膠原沉積和纖維化病變顯著減輕。這直接證明了成纖維細(xì)胞Smo通過(guò)抑制自噬來(lái)促進(jìn)腎臟纖維化。
Smo通過(guò)β-arrestin 1/Src/β-catenin通路抑制成纖維細(xì)胞自噬
機(jī)制上，研究發(fā)現(xiàn)Smo的促纖維化作用不依賴于經(jīng)典的Gli轉(zhuǎn)錄因子，而是通過(guò)一個(gè)非經(jīng)典的途徑。蛋白互作分析提示β-arrestin 1（ARRB1）/Src復(fù)合物可能連接Smo與β-catenin。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Shh/Smo可激活β-arrestin 1/Src信號(hào)，導(dǎo)致β-catenin活化并核轉(zhuǎn)位。而干擾β-arrestin 1或使用β-catenin降解劑KYA1797K，能有效阻斷Smo對(duì)自噬的抑制和對(duì)肌成纖維細(xì)胞的活化作用。這表明Smo通過(guò)β-arrestin 1/Src/β-catenin軸發(fā)揮功能。
Smo/β-catenin/mTOR信號(hào)軸通過(guò)介導(dǎo)自噬缺陷進(jìn)一步激活肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化
那么β-catenin如何抑制自噬？研究人員發(fā)現(xiàn)，β-catenin的轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF能直接結(jié)合到哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因的啟動(dòng)子區(qū)域并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。mTOR是自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。因此，Smo激活的β-catenin會(huì)上調(diào)mTOR表達(dá)，進(jìn)而抑制自噬。過(guò)表達(dá)β-catenin可誘導(dǎo)mTOR、抑制自噬、促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化，而聯(lián)合使用雷帕霉素則能逆轉(zhuǎn)這些表型。這完整勾勒出Smo→β-arrestin 1/Src→β-catenin→mTOR→自噬抑制→肌成纖維細(xì)胞活化的信號(hào)軸。
特異性敲除成纖維細(xì)胞β-catenin可增強(qiáng)自噬并保護(hù)腎臟
與Smo敲除結(jié)果一致，構(gòu)建成纖維細(xì)胞特異性β-catenin敲除小鼠（β-catCKO）也觀察到了類似的保護(hù)效應(yīng)。單細(xì)胞測(cè)序分析顯示，β-catCKO小鼠的成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞比例減少，自噬相關(guān)通路得到增強(qiáng)，而促纖維化通路被抑制。組織學(xué)及分子檢測(cè)證實(shí)，β-catCKO顯著緩解了UUO誘導(dǎo)的腎臟纖維化和肌成纖維細(xì)胞活化。
Smo抑制劑NVP-LDE225在體內(nèi)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞自噬并治療已形成的腎纖維化
最后，研究評(píng)估了靶向干預(yù)的治療潛力。在已形成纖維化的UUO小鼠模型中，給予Smo特異性拮抗劑NVP-LDE225進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，NVP-LDE225能有效抑制腎臟成纖維細(xì)胞中Smo和活性β-catenin的表達(dá)，恢復(fù)自噬功能（增加自噬小體、降低p-mTOR和SQSTM1），并顯著減輕腎臟的ECM沉積、肌成纖維細(xì)胞活化及纖維化病變。這表明靶向抑制Smo對(duì)已建立的腎臟纖維化也具有治療作用。
綜上所述，本研究系統(tǒng)闡明了腎臟纖維化中成纖維細(xì)胞活化的一個(gè)新機(jī)制。在CKD狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞Smo信號(hào)異常激活，通過(guò)β-arrestin 1/Src復(fù)合物激活β-catenin，進(jìn)而上調(diào)mTOR表達(dá)，最終導(dǎo)致成纖維細(xì)胞自噬功能缺陷。這種自噬能力的喪失，驅(qū)動(dòng)了成纖維細(xì)胞向高度增殖和分泌的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而大量產(chǎn)生ECM，加劇腎臟纖維化。研究的重要結(jié)論在于：遺傳學(xué)上特異性敲除成纖維細(xì)胞中的Smo或β-catenin基因，或者藥理學(xué)上使用Smo拮抗劑NVP-LDE225，均能有效恢復(fù)成纖維細(xì)胞的自噬功能，阻斷其活化，從而顯著緩解腎臟纖維化。
這項(xiàng)研究的意義重大。首先，它揭示了Smo信號(hào)調(diào)控成纖維細(xì)胞自噬在腎臟纖維化中的核心作用，深化了對(duì)肌成纖維細(xì)胞活化機(jī)制的理解。其次，它發(fā)現(xiàn)了Smo通過(guò)非經(jīng)典的β-arrestin 1/Src/β-catenin/mTOR軸發(fā)揮作用，為Hedgehog信號(hào)通路的功能提供了新的視角。最重要的是，研究將臨床上用于治療基底細(xì)胞癌的藥物NVP-LDE225重新定位為潛在的抗腎臟纖維化候選藥物，并通過(guò)臨床前模型驗(yàn)證了其療效，為開(kāi)發(fā)治療CKD的創(chuàng)新策略——即靶向調(diào)控成纖維細(xì)胞自噬或抑制其Smo/β-catenin信號(hào)——提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和極具轉(zhuǎn)化前景的干預(yù)途徑。盡管研究存在如未使用Smo基因敲入模型等局限性，但其發(fā)現(xiàn)無(wú)疑為攻克慢性腎臟病這一臨床難題點(diǎn)燃了新的希望。
