《Methods》：Broad Screening of 2-Styrylchromones Identifies dual inhibitors of the COX-2 pathway
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COX-2抑制劑的開發(fā)：2- Styrylchromones的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系及選擇性研究（摘要分隔符
瑪麗安娜·盧卡斯（Mariana Lucas）|瑪麗莎·弗雷塔斯（Marisa Freitas）|丹妮拉·里貝羅（Daniela Ribeiro）|阿圖爾·M.S.席爾瓦（Artur M.S. Silva）|埃杜阿達·費爾南德斯（Eduarda Fernandes）
LAQV，REQUIMTE，應(yīng)用化學(xué)實驗室，藥學(xué)院化學(xué)科學(xué)系，波爾圖大學(xué)，葡萄牙波爾圖4050-313
摘要
環(huán)氧化酶（COX）途徑的調(diào)節(jié)，特別是COX-2活性和表達的調(diào)控，在抗炎治療中起著核心作用。在這項研究中，我們評估了43種結(jié)構(gòu)相關(guān)的2-苯乙烯色酮（2-SC）的COX-2抑制潛力及其對COX-2/COX-1的選擇性。2-SC是一類含有氧的雜環(huán)化合物以及黃酮的乙烯基衍生物。通過體外酶測定法和體外全血測定法評估了COX-2和COX-1的活性，并分析了脂多糖（LPS）刺激的人類白細胞中的COX-2表達情況。在可能的情況下，建立了結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。
在酶測定法中，2-SC B12和B13是活性最強的化合物，其IC50值≤1 μM。這些結(jié)果表明，A環(huán)上C-7和C-8位置以及B環(huán)上C-3′和C-4′位置的兒茶酚基團在抑制COX-2活性中起著關(guān)鍵作用。B12顯示出最高的選擇性指數(shù)。在復(fù)雜的全血基質(zhì)中，B1是唯一一種對COX-2保持輕微活性的2-SC。在細胞水平上，幾種2-SC顯著降低了LPS誘導(dǎo)的人類白細胞中的COX-2表達。值得注意的是，2-SC B6、B7和B9不僅抑制了COX-2的活性和表達，還減少了前列腺素E2的生成，表明它們對該炎癥途徑具有雙重調(diào)節(jié)作用。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明2-SC骨架是一個有前景且尚未充分探索的化學(xué)平臺，可用于合理設(shè)計選擇性的COX-2調(diào)節(jié)劑和創(chuàng)新抗炎藥物。
引言
苯乙烯色酮，也稱為苯乙烯-4H-色酮-4-酮或苯乙烯-4H-1-苯并吡喃-4-酮，是一類含有氧的雜環(huán)化合物，其特征是一個苯并芳環(huán)和一個17碳骨架。它們在結(jié)構(gòu)上與色酮相關(guān)，不同之處在于苯乙烯基團連接在色酮骨架的C-2位置。在這一類化合物中，2-苯乙烯色酮（2-SC）是一個重要的亞組，其苯乙烯基團特異性地連接在色酮核心的C-2位置[1]。大多數(shù)2-SC是合成的，因為它們的天然存在非常稀少，迄今為止僅鑒定出少量的天然2-SC[1]。這些化合物具有多種生物活性，包括抗氧化[2]、[3]、[4]、抗病毒[5]、[6]、神經(jīng)保護[7]、[8]、抗菌[9]、抗真菌[10]、抗糖尿病[11]、[12]、抗腫瘤[13]、[14]、[15]、[16]，尤其是抗炎特性[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。
炎癥是一種復(fù)雜的生理防御機制，是對細胞損傷、感染或病原體入侵等有害刺激的反應(yīng)。它涉及多個信號通路，這些通路共同激活了廣泛的炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)[22]、[23]、[24]。在這些介質(zhì)中，前列腺素（PG）起著核心作用，對炎癥的經(jīng)典癥狀（紅腫、發(fā)熱、疼痛和功能喪失）的發(fā)展至關(guān)重要[25]、[26]。除了其炎癥作用外，PG還參與關(guān)鍵的穩(wěn)態(tài)功能，包括腎臟調(diào)節(jié)、血小板聚集的調(diào)節(jié)以及胃黏膜的保護（圖1）。PG由花生四烯酸（AA）合成，在炎癥部位其生成顯著增加[25]、[26]、[27]、[28]。AA通過磷脂酶A2的作用從膜磷脂中釋放出來，隨后被環(huán)氧化酶（COXs）轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的中間體PGG2，再進一步轉(zhuǎn)化為PGH2。PGH2作為多種終端合成酶（例如血栓烷合成酶、前列腺素環(huán)氧化酶、PGE合成酶、PGF合成酶、PGD合成酶）的底物，生成多種前列腺素[25]、[28]、[29]、[30]（圖1）。因此，COX（也稱為前列腺素H合成酶）是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵同工酶，包括PG和血栓烷（TX），存在三種不同的異構(gòu)體：COX-1、COX-2和COX-3[30]。
COX-1是一種在多種組織中持續(xù)表達的異構(gòu)體，除了在生理上參與PG和TX的生成外，還對多種穩(wěn)態(tài)功能至關(guān)重要。特別是，COX-1通過提供TX合成的前體在血小板聚集中起關(guān)鍵作用。它還對維持胃腸道黏膜的完整性和促進腎臟調(diào)節(jié)及鈣的重吸收至關(guān)重要[25]、[28]、[29]、[30]。相比之下，COX-2是一種誘導(dǎo)型異構(gòu)體，主要在參與炎癥的細胞（如單核細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞）中表達。其表達在多種細胞內(nèi)和細胞外炎癥刺激（例如生長因子、細胞因子、激素和細菌內(nèi)毒素）的作用下上調(diào)[30]。因此，調(diào)節(jié)COX-2活性是控制炎癥反應(yīng)的核心機制[28]、[29]、[30]。COX-3被認為是COX-1的剪接變異體，其主要功能與疼痛和發(fā)熱的調(diào)節(jié)有關(guān)。這種異構(gòu)體主要在大腦、心臟和脊髓中表達[29]、[31]、[32]。
鑒于COX途徑在炎癥反應(yīng)中的核心作用，抑制COX是抗炎效果的關(guān)鍵機制。非甾體抗炎藥（NSAIDs），如雙氯芬酸、布洛芬和阿司匹林，被廣泛用于臨床以調(diào)節(jié)炎癥。這些藥物通過非選擇性抑制COX-1和COX-2來發(fā)揮治療效果，從而減少前列腺素的生成，進而控制疼痛和炎癥。然而，同時抑制持續(xù)表達的COX-1異構(gòu)體會導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，包括胃腸道、心血管和腎臟并發(fā)癥，尤其是在長期使用時。這些限制促使了選擇性COX-2抑制劑（稱為coxibs）的開發(fā)，例如塞來昔布、依托考昔布和瓦德考昔布，它們主要針對與炎癥過程相關(guān)的誘導(dǎo)型COX-2異構(gòu)體，同時保護由COX-1介導(dǎo)的生理功能。盡管coxibs在胃腸道安全性方面比非選擇性NSAIDs有所改善，但它們的臨床使用與心血管事件的風險增加有關(guān)，這導(dǎo)致羅非昔布和瓦德考昔布被撤出市場[33]、[34]、[35]、[36]。在這種情況下，完全的COX-2選擇性可能不是最佳的治療策略。相反，目前認為顯示優(yōu)先抑制COX-2并結(jié)合部分調(diào)節(jié)COX-1的化合物是一種平衡療效和安全性的有前景的方法[37]、[38]、[39]、[40]。盡管如此，尋找能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)化和平衡的COX-1/COX-2調(diào)節(jié)并優(yōu)先抑制COX-2的分子的工作仍在進行中，這突顯了在這一領(lǐng)域繼續(xù)開發(fā)藥物的必要性。
因此，本研究旨在通過評估43種結(jié)構(gòu)相關(guān)的2-SC對COX-2活性的抑制潛力和選擇性來解決這一空白（圖2），并在可能的情況下建立結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）以實現(xiàn)優(yōu)先抑制COX-2。據(jù)此，定義了以下目標：(a) 通過體外酶測定法評估2-SC對人類重組COX-2和COX-1的抑制潛力，并確定它們的COX-2選擇性；(b) 在模擬生理條件的更復(fù)雜生物基質(zhì)（人類全血）中評估它們對COX-2和COX-1的抑制活性，通過量化PGE2的生成；(c) 通過Western blot分析新鮮分離的人類白細胞中的COX-2表達，以更好地表征這些效應(yīng)背后的細胞機制。
試劑
試劑
COX-2抑制劑篩選試劑盒（熒光法）購自BioVision, Inc.（美國加利福尼亞州米爾皮塔斯）。D-葡萄糖、Dulbecco磷酸鹽緩沖液（不含氯化鈣和氯化鎂，PBS）、Cremophor EL、碘化丙啶（PI）、Triton X-100、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸二氫鈉（Na2HPO4）、鈣離子載體A23187、乙酰水楊酸、血紅素、Ampliflu? Red、COX-1、trizma?鹽酸鹽、乙二胺四乙酸（EDTA）二鈉鹽二水合物
2-SC對人類重組COX-2和COX-1的抑制作用
表1總結(jié)了所測試的2-SC對人類重組COX-1和COX-2的抑制效果，僅包括對至少一種異構(gòu)體抑制率超過30%的化合物。根據(jù)B環(huán)上C-4′位置的取代基、B環(huán)上是否存在Cl以及C環(huán)上C-3位置是否存在Br，將研究的2-SC分為八組（A至H組）（圖2）。
A組中，B環(huán)上C-4′位置沒有取代基，只有A8表現(xiàn)出
討論
2-SC作為藥物開發(fā)的候選骨架顯示出廣泛的生物活性[1]。然而，它們的抗炎潛力尚未得到充分探索，迄今為止僅發(fā)表了有限數(shù)量的研究[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。現(xiàn)有報告強調(diào)了2-SC的多種抗炎作用，包括抑制HL-60細胞與Chinese hamster卵巢細胞間粘附分子-1的粘附[17]、抑制核因子κ
結(jié)論
本研究首次全面評估了大量2-SC作為COX-2途徑調(diào)節(jié)劑的作用。結(jié)果表明，特定的結(jié)構(gòu)特征，特別是A環(huán)上C-7和C-8位置以及B環(huán)上C-3′和C-4′位置的兒茶酚基團，是COX-2抑制和選擇性的關(guān)鍵決定因素。在酶測定法中表現(xiàn)出顯著抑制活性的2-SC也對該異構(gòu)體表現(xiàn)出更高的選擇性
倫理聲明
本研究遵循赫爾辛基宣言的原則進行，并獲得了葡萄牙波爾圖Universitário de Santo António醫(yī)院/Abel Salazar生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所倫理委員會的批準。所有參與者在參與研究前均簽署了知情同意書。
CRediT作者貢獻聲明
瑪麗安娜·盧卡斯（Mariana Lucas）：概念化、形式分析、研究、方法學(xué)、初稿撰寫、審閱與編輯。瑪麗莎·弗雷塔斯（Marisa Freitas）：資金獲取、項目管理、監(jiān)督、驗證、審閱與編輯。丹妮拉·里貝羅（Daniela Ribeiro）：概念化、資金獲取、項目管理、監(jiān)督、驗證、審閱與編輯。阿圖爾·M.S.席爾瓦（Artur M.S. Silva）：概念化、資金獲取、項目管理、監(jiān)督、驗證、撰寫利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務(wù)利益或個人關(guān)系可能影響本文所述的工作。
致謝
本工作得到了葡萄牙國家基金（FCT/MECI、科學(xué)技術(shù)基金會和教育部、科學(xué)與創(chuàng)新部）通過項目UID/50006/2025 - 綠色化學(xué)實驗室 - 清潔技術(shù)和工藝以及歐盟 [FEDER基金通過運營競爭力計劃（COMPETE2020）POCI-01-0145-FEDER-029253 - Project PTDC/MED-QUI/29253/2017）的財政支持。瑪麗安娜·盧卡斯感謝FCT和ESF（歐洲社會基金）
