LyeTx I mnΔK是一種源自巴西蜘蛛Lycosa erythrognatha毒液的短肽，其對喹諾酮類抗生素耐藥的致病性大腸桿菌（Escherichia coli）具有抗粘附活性
《Microbial Pathogenesis》：Anti-adhesive activity of LyeTx I mnΔK, a short peptide derived from the Brazilian spider
Lycosa erythrognatha venom, against quinolone-resistant uropathogenic
Escherichia coli
編輯推薦：
本研究評估了巴西狼蛛 venom-derived 肽 LyeTx I mnΔK 對耐喹諾酮類大腸桿菌的抗菌活性，發現其MIC50為2 μM，MBC50為8 μM，并抑制細菌與尿路導管的粘附。分子模擬顯示該肽與FimH的粘附結合口袋結合，且體內實驗證實低毒性，但尿液穩定性不足。
Ihtisham Ul Haq | William Gustavo Lima | Felipe Henrique de Souza Silva | Julio Cesar Moreira Brito | Vera Lúcia dos Santos | Rodrigo Moreira Verly | Rafael Pinto Vieira | Katarzyna Krukiewicz | Maria Elena de Lima
波蘭格利維采市Silesian技術大學物理化學與聚合物技術系，M. Strzody 9，44-100
摘要
尿路致病性大腸桿菌（UPECs）正成為一種日益普遍的病原體，尤其是由于喹諾酮類抗生素耐藥性的出現。在這種情況下，抗菌肽（AMPs）成為對抗耐藥UPECs的有效候選物質。本文評估了從巴西Lycosa erythrognatha蜘蛛毒液中提取的短鏈修飾肽LyeTx I mnΔK對喹諾酮耐藥UPECs的抗菌效果。通過最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、抗粘附作用和抗生物膜效應對其進行了表征。同時，還通過計算機模擬分析了該肽與大腸桿菌FimH粘附素的相互作用，并通過體外和體內實驗評估了其安全性。LyeTx I mnΔK的MIC50和MBC50分別為2 μM和8 μM。在低于抑制濃度的條件下，該肽表現出抗粘附作用，能夠抑制喹諾酮耐藥UPECs細胞在尿管表面的附著。計算機模擬結果表明，LyeTx I mnΔK能夠結合FimH粘附素中的疏水孔洞，而FimH粘附素是促進UPECs附著和生物膜形成的關鍵膜蛋白。盡管在最高劑量（10 mg/kg）下小鼠的肌酐水平升高且腎臟組織結構發生改變，但該化合物在體外和體內均顯示出較低的毒性。總體而言，我們的研究結果表明LyeTx I mnΔK是開發新型抗粘附分子以對抗UPECs的有效候選物，尤其是在經過化學修飾以降低其毒性和提高穩定性的情況下。
引言
尿路感染（UTIs）對臨床實踐具有重要影響，每年全球約有1.5億人受到影響[1]。與UTIs最相關的病原體是尿路致病性大腸桿菌（UPECs），它占社區獲得性感染的75%-80%，以及醫院環境中感染的50%[2][3]。UPECs的一個日益嚴重的問題是抗菌素耐藥性的發展，尤其是對廣泛用于治療UTIs的喹諾酮類藥物的耐藥性。多項研究報道了臨床實踐中喹諾酮耐藥UPECs的不同發生率，這取決于所研究的地理區域、藥物類型以及UTI的類型（即社區獲得性或醫院獲得性）[4][5][6]。例如，Ismaeil等人[5]報告稱，在埃及一家三級醫院的重癥監護病房中分離出的UPECs中，對左氧氟沙星的耐藥率為77%，對環丙沙星為75%，對莫西沙星為59%。Estrada等人[6]報告稱，在墨西哥社區獲得性UTI患者中分離出的大腸桿菌中，對萘啶酸、諾氟沙星和環丙沙星的耐藥率合計為63.5%。此外，一項來自匈牙利醫院的研究顯示，喹諾酮耐藥UPECs在門診患者中的檢出率在46.83%至65.98%之間[7]；瑞士的一項十年研究則發現環丙沙星耐藥率從1.8%上升至15.9%[8]。
編碼拓撲異構酶II（gyrA和gyrB）和/或拓撲異構酶IV（parC和parE）的基因中的喹諾酮耐藥決定區域（QRDR）的突變通過改變這些藥物的結合位點，導致高水平的喹諾酮耐藥性[9]。此外，質粒介導的喹諾酮耐藥基因（如qnr（編碼目標保護蛋白）、aac-6’-Ib（產生修飾喹諾酮的酶）以及oqxA/B和qepA（編碼外排泵）會增強UPECs對喹諾酮的耐受性，從而增加編碼拓撲異構酶基因QRDR突變的可能性[10]。
UPECs與其他大腸桿菌菌株不同，具有多種表型特征，包括粘附能力和溶血活性，這些特性使細菌能夠感染并損害宿主[11]。與UPECs引起的UTIs相關的主要毒力因子之一是粘附素的產生，尤其是1型粘附素和3型菌毛蛋白。超過90%的尿路致病性大腸桿菌菌株表達1型菌毛粘附素，該粘附素在小鼠中對于UTIs的建立至關重要[12]。1型菌毛是一種長結構，由含有甘露糖特異性結合蛋白FimH的亞單位組成。FimH能夠與尿路上皮細胞中大量存在的尿上皮蛋白結合，從而確保細菌在組織上的穩定附著[13]。值得注意的是，FimH還參與UPECs在生物和非生物表面（如尿管）上的生物膜形成。在這方面，FimH在與導管相關的UTIs中起著核心作用，這是最常見的復雜UTIs形式之一[14]。
由于FimH在宿主-病原體相互作用和生物膜形成過程中的關鍵作用，它成為開發新型抗菌劑的有希望的分子靶點[12][15]。口服給予一種抑制FimH的小分子（50 mg/kg）可將感染大腸桿菌的動物膀胱內的細菌負荷降低1000倍以上[15]。此外，在導管相關生物膜模型中，使用特定的FimH抑制劑（如對氰聯苯-α-甘露糖苷）可將1型菌毛介導的生物膜質量減少50%[16]。因此，幾乎所有相關研究都使用了具有抗FimH活性的D-甘露糖類似物。因此，探索其他抑制FimH的化合物（如抗菌肽（AMPs）可能有助于理解這類新型抗菌劑的藥理學和藥物化學特性。
AMPs是由所有生物（從植物到動物）的先天免疫反應自然產生的化合物[17]。與小分子相比，這些化合物具有多種優勢，如快速的殺菌效果、廣譜抗菌活性、抗生物膜作用、不會產生污染環境的殘留物，以及較低的誘導耐藥性的傾向。AMPs的來源多種多樣，但節肢動物毒素因其豐富的生物活性物質而備受關注[18]。已從節肢動物（如蜘蛛）中分離出多種具有治療應用的AMPs。其中，Lycosidae、Oxyopidae、Clubionidae、Thomisidae、Linyphiidae和Tetragnathidae等蜘蛛科在農業生態系統中尤為重要，從中已鑒定出多種具有治療特性的AMPs[19]。在Lycosidae科中，Lycosa erythrognatha是一種常見的蜘蛛，俗稱“狼蛛”、“花園蜘蛛”或“tarantula”[20]。L. erythrognatha的毒液是高效AMPs的來源[21]。關于L. erythrognatha毒液衍生的AMP LyeTx I（H-IWLTALKFLGKNLGKHLAKQQLAKL-NH2；2831.10 Da）的首份報道發表于2010年，由Santos等人發表[22]。LyeTx I對多種重要病原菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、表皮葡萄球菌、鏈球菌和肺炎克雷伯菌）以及真菌（Pichia kudriavzevii - 前稱為Candida krusei和Cryptococcus neoformans）具有抗菌活性[22][23][24]。隨后，基于LyeTx I原型開發了多種類似物[23][25]，其中一種名為LyeTx I mnΔK的肽在5位插入了賴氨酸殘基[23]。
LyeTx I mnΔK是一種膜活性短鏈合成肽，在抗菌效果、溶血活性和神經毒性之間實現了優化平衡[26]。LyeTx I mnΔK對多重耐藥（MDR）微生物（如碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和耐氟康唑的白念珠菌）具有抗菌作用，并且在測試條件下不會誘導微生物耐藥性[27]。此外，最近有研究報道[26]，[68]Ga]-DOTA(K)-LyeTx I mnΔK可用作正電子發射斷層掃描（PET）成像中的放射性藥物。
因此，鑒于其優異的抗菌效果、低毒性和在測試條件下不會誘導耐藥性的特點，我們旨在評估這種AMP對喹諾酮耐藥UPECs中FimH的抑制潛力。在尿管相關模型中測定了該化合物的抗粘附作用，并在體內和體外測定了其在泌尿系統結構中的毒性。此外，還利用化學信息學工具研究了LyeTx I mnΔK與大腸桿菌FimH的相互作用機制。
試劑
美羅培南、多粘菌素（Inlab?；巴西圣保羅州）、冰醋酸、甲醇、氯化鈉（NaCl）、二甲基亞砜（DMSO）、hematoxylin、eosin、結晶紫、磷酸鹽緩沖液（Synth?；巴西圣保羅州Diadema）、卡托胺、賽拉嗪（Syntec?；巴西圣保羅州）、Tween-80?（聚山梨酯80）、3-(4,5-二甲噻唑-2-yl)-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）（Sigma-Aldrich?；美國密蘇里州圣路易斯）、胎牛血清（FBS）、Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）等。
結果
如表3所示，所有測試的肽都對UPECs具有抗菌活性，MIC范圍為2 μM至64 μM。原型LyeTx I的50%抑制濃度（MIC50）為4 μM。根據肽的結構-活性關系研究（SARS，圖1），去除LyeTx I中的組氨酸（H）殘基后得到的類似物LyeTx I-b的抗菌活性降低（MIC50為16 μM）。
討論
在本研究中，我們評估了從L. erythrognatha蜘蛛毒液中提取的AMPs對喹諾酮耐藥UPECs的抗菌潛力。根據Mbaveng等人的研究，當MIC小于10 μM時，天然化合物的抗菌活性被認為是高的；當MIC在10 μM到100 μM之間時為中等；當MIC大于100 μM時為低[46]。原型化合物LyeTx I對喹諾酮耐藥UPECs的抗菌效果被歸類為高效（MIC50為4 μM），這一結果得到了證實。
結論
LyeTx I mnΔK被證明是對喹諾酮耐藥UPECs浮游細胞有效的抗菌劑。此外，由于它能夠結合FimH粘附素中的疏水孔洞，LyeTx I mnΔK肽能夠抑制UPECs細胞在尿管表面的附著。然而，我們不能排除該肽對抗UPECs的其他可能機制。考慮到LyeTx I mnΔK在尿液中的穩定性較低以及其腎臟毒性……
機構審查委員會聲明
動物實驗方案已獲得圣卡薩德貝洛奧里藏特大學倫理委員會（協議編號001/2023；批準日期：2023年3月23日）的批準，用于涉及動物的研究。
數據可用性聲明
本文的原始貢獻包含在文章中。如有進一步疑問，請聯系相應作者。
CRediT作者貢獻聲明
Ihtisham Ul Haq：方法學、研究、概念構思。
William Gustavo Lima：撰寫 – 初稿、軟件開發、方法學、研究、概念構思。
Felipe Henrique de Souza Silva：方法學。
Julio Cesar Moreira Brito：撰寫 – 審稿與編輯、方法學。
Vera Lúcia dos Santos：撰寫 – 審稿與編輯。
Rodrigo Moreira Verly：撰寫 – 審稿與編輯。
Rafael Pinto Vieira：撰寫 – 審稿與編輯。
Katarzyna Krukiewicz：撰寫 – 審稿與編輯、數據分析。
資助
巴西國家科學技術發展委員會（CNPq）[項目編號CNPq 32/2023 - 2023年青年博士后項目 - PDJ 2023；研究生產力獎學金MEL過程310.638/2023-2]。米納斯吉拉斯州研究支持基金會（FAPEMIG）[研究生產力獎學金BIP-00152-23；Mineira肽類研究網絡-RED-00185-23；項目APQ 00754-24；項目APD-00359-25（FAPEMIG項目編號04/2025 - 為博士提供博士后獎學金支持）。
致謝
l.U.H和R.P.V感謝Capes/Fapemig的38/2022年度III期研究生發展戰略合作伙伴計劃、FAPEMIG APQ-05072-23項目以及RPI Bionano - FAPEMIG RED-00081-23項目的財政支持。W.G.L感謝巴西國家科學技術發展委員會（CNPq）提供的博士獎學金[項目編號CNPq 32/2023 - 2023年青年博士后項目 - 過程172441/2023-4]。
