《Microbial Pathogenesis》：Molecular Insights into the Oxidative Perturbation of VIM-2 Metallo-β-Lactamase: Active Site Remodeling Restores Imipenem Susceptibility in
Pseudomonas aeruginosa
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亞抑制性過氧化氫通過氧化VIM-2金屬酶的Cys221殘基，破壞其活性位點幾何構象，顯著降低碳青霉烯類藥物耐藥性（MIC值4-8倍下降），并抑制生物膜形成，為新型抗耐藥策略提供結構基礎。
Bashar IBRAHIM | Jenan Atiyah GHAFIL | Zahraa Ali ABDULLAH | Neslihan Kaya KINAYTüRK | Sultan M. ALSHAHRANI | Barakat A. KHAN | Ayaid Khadem ZGAIR
土耳其伊斯帕爾塔蘇萊曼·德米雷爾大學藥學院藥學微生物學系
摘要
背景
全球范圍內碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌（CRPA）的蔓延，主要由VIM-2金屬β-內酰胺酶（MBL）引起，這迫切需要創新的輔助策略。本研究探討了亞抑制濃度的過氧化氫（H?O?）通過靶向VIM-2的結構和催化弱點來恢復伊米培南（IMP）敏感性的潛力。
方法
共篩選了86株臨床分離株，其中一株高耐藥性/高生物膜形成的分離株（Pa13）被選為深入研究的對象。通過棋盤法和生物膜測定法評估了亞MIC濃度下的H?O?與IMP的協同增強效應。為了解其分子機制，我們利用100納秒分子動力學（MD）模擬和對純化VIM-2的LC-MS/MS分析來識別特定位點的氧化修飾。通過測量酶動力學參數（Km和Vmax）來區分整體變性與靶向催化損傷。
結果
亞抑制濃度的H?O?顯著降低了多種分離株的IMP MIC（4至8倍），并抑制了生物膜的形成。動力學分析顯示Vmax降低了66%，而Km相對穩定，表明催化機制受到了局部破壞。LC-MS/MS分析確定Cys221是氧化轉化為磺酸酯和亞砜酯的主要靶點。MD模擬證實，Cys221的氧化在保持Km穩定和對接分數的同時，會觸發活性位點的重構，從而破壞了底物識別與酶催化之間的幾何對齊，有效解耦了這兩者。
結論
這些發現表明Cys221是VIM-2活性位點中的一個關鍵“氧化還原開關”。特定位點的氧化擾動能夠在不導致蛋白質整體變性的情況下有效抑制酶的耐藥性。本研究為開發基于氧化還原的輔助劑以對抗CRPA中的MBL介導的耐藥性提供了堅實的結構基礎。
部分內容摘錄
背景
CRPA的臨床管理受到MBL產生的嚴重阻礙，這些MBL甚至使得最后手段的碳青霉烯類抗生素也失效[1]。
盡管全球范圍內的流行情況各不相同，但核心問題是VIM-2金屬β-內酰胺酶，它通過利用雙核鋅（Zn2?）中心提供耐藥性。這種催化機制能夠精確激活水分子以水解碳青霉烯環，使該酶成為生化干預的主要靶點[2][3]。
細菌的分離與鑒定
從巴格達教育醫院燒傷科的感染傷口樣本中無菌收集了86株分離株，這些樣本來自72小時內未接受抗生素治療的患者，并獲得了患者的知情同意。將拭子接種在MacConkey瓊脂（HiMedia，印度，Cat M008）上，并在37°C下培養18小時。非發酵菌落具有色素、扁平擴散形態和黏液特征[21][22]。使用VITEK 2系統（bioMérieux，法國）確認這些分離株為銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）。
Kirby-Bauer方法
細菌分離株
從86份感染傷口拭子中獲得了20株銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）。顯微鏡和生化測試以及VITEK 2技術的驗證確認了它們的身份。研究發現，傷口感染中銅綠假單胞菌的檢出率為23.25%。非銅綠假單胞菌的分離株被排除在外。
抗生素敏感性及生物膜形成
圖1A展示了這些分離株的敏感性及生物膜特征。為了驗證我們的測試方法，我們分析了IMP MIC與菌落直徑之間的相關性，發現兩者之間存在顯著負相關。
討論
本研究發現臨床傷口分離株中存在高比例的CRPA，且生物膜產生能力與IMP敏感性呈顯著負相關。觀察到的表型異質性表明，IMP耐藥性是一個多因素現象，其中生物膜介導的耐受性與其他分子決定因素（如外排泵上調和孔道修飾）共同作用[38][39]。這些發現強調了...
結論
本研究為新型抗生素耐藥性策略提供了重要基礎。我們的研究發現，亞抑制濃度的H?O?通過強烈的協同作用有效增強了CRPA對IMP的敏感性，為創新治療策略開辟了新途徑。研究強調了生物膜在抗生素耐藥性中的關鍵作用，以及H?O?在減少生物膜形成方面的有效性。
CRediT作者貢獻聲明
Sultan M. ALSHAHRANI：驗證、軟件使用、資金獲取。
Barakat A. KHAN：撰寫、審稿與編輯、軟件使用、概念構思。
Ayaid Khadem ZGAIR：撰寫、審稿與編輯、軟件使用、資源準備、方法學設計。
Bashar IBRAHIM：數據可視化、驗證、資源準備、數據分析。
Jenan Atiyah GHAFIL：撰寫、審稿與編輯、資源準備、方法學設計、數據整理。
Zahraa Ali ABDULLAH：數據可視化、軟件使用。
Neslihan Kaya K?naytürk：驗證、方法學設計。
倫理審批與參與同意
伊拉克巴格達大學理學院生物系的人類倫理委員會批準了這項研究，并于2024年11月8日提供了正式的批準函，編號為CSEC/1124/0098。
出版同意
不適用。
數據與材料的可用性
本研究生成或分析的所有數據均包含在本文中。
手稿準備過程中使用生成式AI和AI輔助技術的聲明
在準備本文過程中，作者使用了ChatGPT來優化學術表達并提高手稿的可讀性（特別是摘要/引言部分）。使用該工具/服務后，作者根據需要對內容進行了審查和編輯，并對出版物的內容負全責。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
數據獲取
支持本研究結果的數據可向通訊作者索取。
資金支持
作者感謝King Khalid大學的研究與研究生院通過項目編號RGP2/82/46提供的資金支持。
致謝
作者感謝巴格達大學理學院
生物系的所有工作人員在實驗工作期間的支持。
