《Microchemical Journal》：HS-GC-IMS authenticates the botanical origin of seven types of Italian monofloral honey, annotating the significant volatile compounds by the novel HS- SPME-GC-IMS-MS prototype
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單花蜜鑒定、HS-GC-IMS、機器學習、揮發性化合物分析、意大利
菲利波·帕尼（Filippo Panni）| 安德烈亞·馬薩羅（Andrea Massaro）| 盧卡斯·博登本德（Lukas Bodenbender）| 卡梅拉·扎科梅蒂（Carmela Zacometti）| 羅伯托·皮羅（Roberto Piro）| 安杰拉·費利西塔·薩維諾（Angela Felicita Savino）| 菲利普·韋勒（Philipp Weller）| 亞歷山德拉·塔塔（Alessandra Tata）
意大利農業、糧食主權和林業部，農業食品產品質量監管與欺詐打擊中央監察局（ICQRF），佩魯賈實驗室，Via della Madonna Alta 138 c/d，佩魯賈，PG，意大利
摘要
歐洲理事會通過了2024/1434號指令，以加強蜂蜜的市場標準并改進標簽標識。為打擊蜂蜜欺詐行為，理事會建議加強監管并采用創新方法來檢測蜂蜜摻假和錯誤標注現象。為此，我們探討了頂空氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）的分析能力。具體來說，我們研究了HS-GC-IMS結合統計學方法是否能夠有效驗證意大利單花蜂蜜的來源。我們直接分析了2022年和2023年收獲的136種意大利單花蜂蜜樣本，這些蜂蜜來自七種不同的花卉來源（金合歡、蒲公英、栗子、杜鵑花、柑橘、向日葵和椴樹）。這些樣本之前已經通過感官分析和理化評估進行了鑒定。預處理后的數據經過主成分分析（PCA）以探索HS-GC-IMS的區分能力。隨后，基于PLS-DA的機器學習分類器分別實現了93.10%、90.0%和98.75%的準確率、靈敏度和特異性。
最后，我們使用頂空固相微萃取氣相色譜-離子遷移譜-質譜（HS-SPME-GC-IMS-MS）原型技術對每種單花蜂蜜中特征性揮發性化合物進行了鑒定。這是首次報道這種具有雙重檢測系統的新型原型技術，用于鑒定不同單花蜂蜜中的揮發性有機化合物。
這些結果證明了：i) 這種結合HS-GC-IMS與機器學習的協同方法在蜂蜜鑒定中的潛在效用；ii) HS-SPME-GC-IMS在準確鑒定蜂蜜揮發性化合物方面的開創性能力。
引言
單花蜂蜜因其主要由單一植物的花蜜制成而具有獨特的風味。根據花卉來源的不同，單花蜂蜜具有特定的感官特性、理化性質和健康益處，這些因素使其商業價值高于混合蜂蜜。因此，單花蜂蜜比其他類型的蜂蜜更容易被錯誤標注。
由于許多從非歐盟國家進口的蜂蜜涉嫌摻假或地理來源標注不實（歐盟“來自蜂箱”協調行動2021–2022），歐洲議會和理事會于2024年5月14日通過了2024/1438號指令，對2001/110/EC指令進行了修訂。該指令旨在加強蜂蜜的市場標準并改進標簽標識。具體而言，歐洲理事會通過了2024/1434號指令，以加強蜂蜜的市場標準并改進標簽標識。修訂內容及相應的2024/1438號指令于2024年5月24日公布，旨在解決歐洲日益嚴重的蜂蜜真實性問題。在理事會辯論中，多位部長強調僅靠標簽標識不足以防止海外生產商的不公平競爭，并敦促委員會開發分析方法來檢測蜂蜜并打擊欺詐行為。實際上，2024/1432號指令明確規定應建立歐盟蜂蜜參考實驗室，通過標準化方法加強監管、檢測蜂蜜摻假，并使用最新的創新測試方法系統地驗證蜂蜜的真實性與質量。
目前，在官方檢測中，蜂蜜的植物來源是通過蜜花粉學和感官分析來確定的。UNI 11299:2008標準指南指出，蜜花粉學通過識別和量化蜂蜜沉積物中的花粉及其他微觀元素來確定產品的植物和地理來源。經過濃縮處理后，這些微觀元素在顯微鏡下觀察，并進行鑒定和計數，從而生成花粉譜圖，需要蜜花粉學專家進行專業解讀以獲取有關蜂蜜來源的信息。需要注意的是，由于蜜蜂不會只采集一種植物的花蜜，單花蜂蜜在花粉成分上存在固有的變異性。此外，蜜花粉學分析耗時較長，且需要高度專業的人員來正確鑒定花粉種類。
感官分析常用于解釋蜜花粉學分析結果。蜂蜜的質量評估通過外觀、香氣、風味和觸感等感官特征進行。[34] 傳統的蜂蜜感官評估方法在全世界范圍內被廣泛使用，對質量控制和質量提升具有重要意義，但該方法需要專業培訓，且可能存在主觀判斷。
為克服蜜花粉學和感官分析的主觀性問題，人們提出了多種分析方法來鑒定單花蜂蜜。[62] 另一種常規方法是基于測量多種理化參數來驗證蜂蜜的植物來源。[41] 當所有測得的理化參數符合相應技術規格時，單花蜂蜜樣本被歸類為特定類型。[41] 近年來，多種光譜和色譜技術也被用于蜂蜜的鑒定。[12–55] 在食品真實性鑒定中，頂空氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）是一種極具前景和創新性的分析技術。[8] HS-GC-IMS的工作原理類似于質譜法，但揮發性化合物的分離基于離子遷移率而非質荷比（m/z）。HS-GC-IMS的工作原理包括兩次分離：首先通過氣相色譜柱分離樣品化合物，然后在IMS的離子化管內進行化學離子化。分析物離子在電場加速作用下向法拉第板探測器移動，在漂移管（連接光柵和法拉第板的管道）中，離子由于電場加速與漂移氣體（氮氣）碰撞產生的減速作用而以恒定速度運動。離子通過漂移管所需的時間稱為漂移時間，這一時間特征取決于離子的質量和幾何結構。[14] 產生的離子電流隨時間被電磁計測量。
HS-GC-IMS已被用于識別食品欺詐行為：區分不同品種的蜂蜜（如冬季蜂蜜與普通蜂蜜）[57]、驗證橄欖油的真實性[10–22, 54, 56]、判斷用于新鮮意大利面的雞蛋的新鮮度[9]、評估黑胡椒的真實性[59]以及鑒定罌粟殼和胡椒的質量[44]。姚等人使用GC-IMS分析了弋江子單花蜂蜜的香氣特征[58]。HS-GC-IMS還可用于驗證食品的地理來源。[11–48]
此外，Alia?o-González等人使用GC-IMS檢測并量化了蜂蜜中添加的糖漿。[1, 2] 馮等人利用GC-IMS分析了蜂蜜粉[16]。Schanzmann等人區分了北歐生產的椴樹、金合歡、油菜籽和銀杉蜂蜜[49]。值得注意的是，盡管目前結合保留時間和IMS漂移時間的數據庫尚未完善，但質譜與IMS數據的創新結合有望實現更高效的鑒定過程。[6]
本研究旨在確定HS-GC-IMS結合機器學習是否能夠有效鑒定意大利單花蜂蜜的植物來源。為此，我們在2022年和2023年收集了來自意大利七個不同植物來源的單花蜂蜜樣本，并使用HS-GC-IMS進行了分析。處理后的數據用于構建和驗證偏最小二乘判別分析（PLS-DA）分類器，并計算了性能指標。使用HS-SPME-GC-IMS原型技術鑒定了每種花卉來源的特征性揮發性化合物。如前所述，已有研究利用HS-GC-IMS分析了多種食品中的揮發性有機化合物。[23] 例如，2024年的一項研究使用GC-IMS結合GC–MS區分牦牛奶和牦牛肉中的揮發性化合物。[60] 然而，目前的集成方式仍局限于獨立的GC-IMS和GC–MS分析（或正交、順序工作流程），尚未實現同時捕獲保留時間（GC）、遷移率（IMS）和質譜數據的功能。在本研究中，我們使用了結合了HS-SPME-GC-IMS的集成平臺，首次實現了在單一工作流程中同時分離、檢測和解析蜂蜜中的揮發性有機化合物。
樣本
意大利國家養蜂協會（Osservatorio Nazionale Miele）收集了2022年和2023年在意大利收獲的136種單花蜂蜜（n=131份），或者由佩魯賈ICQRF實驗室從其官方檢測材料中提供（n=5份）。分析對象包括來自七種不同花卉來源的蜂蜜：金合歡（n=27份）、栗子（n=22份）、柑橘（n=...）
HS-GC-IMS光譜熱圖的評估
通過對蜂蜜進行HS-GC-IMS分析，獲得了HS-GC-IMS光譜（強度與GC保留時間、IMS漂移時間的關聯圖，即熱圖）。每種檢測到的揮發性化合物都作為信號顯示，其濃度與紅色程度成正比。圖2A-G展示了每種單花蜂蜜的代表性HS-GC-IMS光譜。對于椴樹、柑橘和蒲公英類別，獲得了非常清晰的三維色譜圖；而對于栗子類別...
討論
HS-GC-IMS在鑒定七種單花蜂蜜方面的有效性得到了充分證明。與我們的團隊之前測試的方法（包括環境質譜技術和差分IMS [35, 36]）相比，HS-GC-IMS具有顯著優勢，尤其是在通過保留時間和漂移時間實現二維分離方面提高了選擇性。該方法無需任何富集步驟和/或樣品稀釋...
結論
總之，我們的研究表明，HS-GC-IMS結合多元統計方法是一種有效且經濟的方法，可以快速根據植物來源對單花蜂蜜進行分類。初步篩選驗證了每批蜂蜜標注的植物來源的真實性。最后，使用具有雙重檢測功能的原型技術鑒定了每種單花蜂蜜中的特征性揮發性化合物。
CRediT作者貢獻聲明
菲利波·帕尼（Filippo Panni）：撰寫初稿、研究設計、方法學制定、驗證、數據可視化、審稿與編輯。安德烈亞·馬薩羅（Andrea Massaro）：審稿與編輯、撰寫初稿、正式數據分析。盧卡斯·博登本德（Lukas Bodenbender）：審稿與編輯、撰寫初稿、數據可視化、方法學研究、數據管理。卡梅拉·扎科梅蒂（Carmela Zacometti）：撰寫初稿、研究設計、數據管理。羅伯托·皮羅（Roberto Piro）：項目監督、資金籌集、概念構思、撰寫...
資金支持
本研究得到了意大利農業、糧食主權和林業部（MASAF）的支持，具體資金來自“2025年和2026年國家養蜂計劃子項目的撥款分配”。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
作者感謝Osservatorio Nazionale Miele的Lucia Piana、Giancarlo Naldi和Alberto Contessi提供的寶貴幫助。
