《Mitochondrion》：Patient-derived TWNK variants recapitulate multisystem Perrault syndrome pathology in a mouse model
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本文針對罕見遺傳病Perrault綜合征缺乏理想動物模型的難題，研究人員通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術，首次構建了攜帶患者特異性TWNK基因復合雜合（c.814G>A/c.1166C>T）及純合突變的小鼠模型。該模型成功模擬了患者的核心病理特征，包括感覺神經性聽力損失、運動功能減退、軸突性周圍神經病變，并揭示了線粒體DNA（mtDNA）拷貝數及ATP合成減少等關鍵分子機制。該研究為深入探索Perrault綜合征的致病機理及開發靶向治療策略提供了重要的臨床前研究平臺。
Perrault綜合征（PS）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，患者通常在嬰幼兒期即出現雙側感音神經性耳聾，女性患者成年后往往伴隨卵巢功能衰竭，部分患者還會出現進行性的神經系統癥狀，如運動障礙、周圍神經病變等。這種疾病與九個基因的突變有關，其中TWNK基因編碼的線粒體DNA（mtDNA）解旋酶Twinkle對維持mtDNA的穩定與復制至關重要。盡管其臨床與遺傳基礎逐漸清晰，但該病發病率極低，導致獲取患者樣本異常困難，嚴重制約了其致病機制的深入研究和潛在療法的開發。更為棘手的是，此前已有的Twinkle全身敲除小鼠模型在胚胎期即致死，而組織特異性敲除模型又無法完全模擬患者多系統受累的復雜病理特征。同時，雖然存在用于研究常染色體顯性遺傳性進行性外眼肌麻痹的Twinkle點突變小鼠模型，但它們并不能重現Perrault綜合征特有的聽力損失和神經學特征。因此，開發能夠精準模擬患者特異性突變的疾病模型，成為了破局的關鍵。
為了解決上述難題，一項發表于《Mitochondrion》期刊的研究邁出了關鍵一步。研究人員從一位攜帶TWNK基因復合雜合突變（c.811G>A/p.Ala271Thr 和 c.1163C>T/p.Ala388Val）的Perrault綜合征患者出發，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，成功構建了對應小鼠同源位點（c.814G>A/p.Ala272Thr 和 c.1166C>T/p.Ala389Val）的純合及復合雜合突變小鼠模型。該研究首次建立了能夠系統性再現Perrault綜合征多系統病理的遺傳精確小鼠模型，為深入解析疾病機制和評估靶向治療策略提供了前所未有的平臺。
研究人員在開展這項研究時，運用了幾個關鍵技術方法。他們首先通過CRISPR/Cas9介導的同源重組，將患者來源的TWNK點突變精確引入C57BL/6小鼠基因組，構建了純合（TwinkleA272T、TwinkleA389V）和復合雜合（TwinkleA272T/A389V）基因型小鼠。隨后，他們通過聽覺腦干反應（ABR）測試評估了小鼠的聽覺功能，利用開放場地實驗（OFT）和步態分析來量化其運動行為，并借助透射電子顯微鏡觀察了坐骨神經的髓鞘超微結構。在分子層面，研究團隊采用定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測了肌肉和腦組織中的線粒體DNA（mtDNA）拷貝數，并使用熒光素酶法測定了組織ATP含量，以評估線粒體功能。
4.1. 患者復合雜合TWNK突變的鑒定與致病性評估
研究人員對一位Perrault綜合征患者及其家系進行了基因分析，發現該患者攜帶TWNK基因c.811G>A (p.Ala271Thr) 和 c.1163C>T (p.Ala388Val) 的復合雜合突變，分別遺傳自其父母。生物信息學分析顯示，這兩個突變位點在多個物種中高度保守，且致病性預測軟件（PolyPhen-2）評分提示其可能損害蛋白質功能。這為后續構建對應的小鼠突變模型提供了遺傳學和分子學依據。
4.2. 重現人類Perrault綜合征突變的Twinkle突變小鼠模型的構建與驗證
利用CRISPR/Cas9技術，研究團隊成功構建了攜帶p.Ala272Thr、p.Ala389V突變（分別對應人類p.Ala271Thr和p.Ala388V突變）的純合及復合雜合Twinkle突變小鼠。基因型測序證實了突變的成功引入。體重監測顯示，突變小鼠從出生到16周齡的總體生長狀況與野生型小鼠相比無顯著差異，表明突變并未影響小鼠的整體生長發育。
4.3. Twinkle突變小鼠表現出嚴重聽覺損傷，呈現感音神經性耳聾表型
對4月齡小鼠進行的聽覺腦干反應（ABR）測試表明，所有基因型的突變小鼠在點擊聲和純音（8-32 kHz）刺激下的聽覺閾值均顯著高于野生型對照，且ABR波V的振幅顯著降低。這證實了Twinkle突變導致了小鼠嚴重的聽力損失，成功模擬了Perrault綜合征患者的核心癥狀之一。
4.4. Perrault綜合征小鼠模型中的線粒體功能障礙：mtDNA耗竭與ATP缺乏
分子檢測發現，與野生型相比，Twinkle突變小鼠在骨骼肌和腦組織中的mtDNA拷貝數均顯著降低。與此同時，這些組織中的ATP含量也明顯下降。這揭示了TWNK突變通過破壞mtDNA的穩定與復制，導致細胞能量（ATP）合成障礙，從而為患者的聽力損失和神經癥狀提供了分子病理學解釋。
4.5. Twinkle突變小鼠存在運動缺陷和周圍神經病變，但步態協調性保留
行為學測試顯示，突變小鼠在開放場地中的總運動距離顯著減少，表明其存在運動能力減退。透射電鏡觀察發現，突變小鼠的坐骨神經中大型有髓神經纖維數量明顯減少，證實了周圍神經軸突病變的存在。然而，步態分析表明突變小鼠的靜止步態模式正常，前后肢運動協調，未見拖拽現象。這說明Twinkle突變導致了外周神經病變和整體運動功能下降，但基本的步態協調性尚未受損。
綜合來看，該研究成功構建了首例能夠系統性重現Perrault綜合征多系統病理特征的TWNK點突變小鼠模型。與以往主要用于研究其他線粒體病（如adPEO）的Twinkle模型不同，本研究構建的A272T/A389V復合雜合突變小鼠不僅存活至成年，而且精準模擬了患者的聽覺喪失、運動障礙、軸突性周圍神經病變等核心臨床表型，并揭示了其背后的線粒體功能障礙機制——即mtDNA拷貝數減少和ATP合成不足。這一模型克服了患者樣本稀少、異質性大以及傳統基因敲除模型胚胎致死或無法模擬全身性病變的局限性。盡管模型未能重現女性患者的卵巢功能障礙（可能源于物種差異或表型不完全外顯），但其在神經系統和聽覺系統上的成功模擬已極具價值。該模型為在遺傳背景均一的條件下，系統性研究Perrault綜合征的發病機制、疾病進程以及評估潛在的治療干預措施（如針對線粒體功能的藥物或基因療法）提供了一個至關重要的臨床前平臺。這項研究不僅填補了Perrault綜合征缺乏理想動物模型的研究空白，也為未來開發針對此類罕見遺傳性線粒體疾病的精準治療策略奠定了堅實的基礎。
