顳下頜關節骨關節炎（Temporomandibular joint osteoarthritis, TMJOA）是一種進行性退行性疾病，影響下頜髁突軟骨和軟骨下骨，導致關節疼痛、活動受限和功能障礙。與其它關節的透明軟骨不同，下頜髁突在細胞組成和細胞外基質上具有獨特性，其發病機制極為復雜，涉及軟骨基質降解、軟骨細胞代謝、細胞死亡、軟骨下骨重塑以及滑膜組織和滑液介導的炎癥等多方面。然而，軟骨和骨退行性病變的復雜機制遠未被闡明。炎癥失調軟骨細胞代謝并導致基質降解已被廣泛認知。外界刺激觸發滑膜組織的炎癥反應，導致髁突表層組織損傷，引起軟骨侵蝕和開裂。越來越多的證據表明，骨軟骨連接處是軟骨侵蝕發生的另一個重要部位，軟骨細胞肥大、異常的內軟骨成骨和血管生成共同促進了骨關節炎的進展。這些機制可能涉及復雜的細胞和信號網絡，而對這些網絡缺乏詳細的表征阻礙了對病理機制的理解。本研究旨在填補這一研究空白。

通過構建前牙早接觸（anterior premature contact, APC）模型和單側前牙反??（unilateral anterior crossbite, UAC）模型，成功誘導了小鼠下頜髁突出現顯著的TMJOA樣病變。組織學顯示軟骨表面粗糙、被骨化區域侵蝕、軟骨層厚度減少以及軟骨內細胞排列紊亂。對對照組、APC組和UAC組三個數據集進行無監督聚類分析后，捕獲的細胞被劃分為14個不同的細胞簇，主要歸類為軟骨細胞、免疫細胞以及內皮細胞/周細胞。與對照組相比，APC或UAC模型組的髁突中軟骨細胞比例下降，而免疫細胞比例增加。

軟骨細胞是下頜髁突的主要細胞成分，在穩態下占所鑒定細胞總數的91.36%，占非免疫細胞的98.65%。軟骨細胞在轉錄表達和生物學功能上具有高度異質性。單細胞RNA測序（scRNA-seq）結合三個數據集，根據不同的基因表達譜和功能，將軟骨細胞進一步區分為16個細胞簇，最終歸納為8個功能亞群：

在穩態下，軟骨細胞祖細胞和纖維化軟骨細胞位于髁突淺層，NOS2^high炎癥相關軟骨細胞位于淺層下方，Col10a1^high肥大軟骨細胞位于深層靠近骨軟骨連接處，而MMP13^high和OCN^high軟骨細胞則位于深層上方。

單細胞轉錄組學揭示了咬合紊亂誘導的TMJOA髁突中的轉錄組變化。APC和UAC模型均導致軟骨細胞頻率降低。與健康髁突相比，APC模型髁突中Mmp13^high軟骨細胞、Col10a1^high肥大軟骨細胞比例增加，而炎癥相關軟骨細胞比例減少；UAC模型髁突中Col10a1^high肥大軟骨細胞、炎癥相關軟骨細胞比例減少，而Mmp13^high軟骨細胞、纖維化軟骨細胞和修復性軟骨細胞比例增加。軟骨細胞祖細胞的比例在兩個模型中均有輕微上升。偽時間分析表明，APC和UAC模型中軟骨細胞的發育軌跡被打亂，與免疫熒光觀察到的細胞排列紊亂、失去簇依賴性表型特征的結果一致。

免疫細胞被聚類為12個群體，進一步注釋為9種不同的細胞類型。咬合紊亂模型顯著增加了免疫細胞的頻率。免疫細胞簇的組成分析表明，在TMJOA中，中性粒細胞（尤其是II期中性粒細胞亞群）擴增，而單核細胞、巨噬細胞和B細胞則顯著縮減少。在APC模型的中性粒細胞前10個差異表達基因中，觀察到Abcg1顯著上調和Ftl1下調，表明脂質穩態和細胞鐵代謝失調；而在UAC模型中，中性粒細胞中Hspa1a/b、Il1r2和Thbs1的表達增加，表明修復和組織重塑增強。

轉錄推斷分析發現了軟骨細胞與免疫細胞亞群之間存在相互作用，并且在咬合紊亂模型髁突中這種作用增強，但相互作用的信號通路存在差異。與健康對照組相比，TNF信號通路被推斷為APC模型髁突中增強最顯著的信息流，而骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）信號則是UAC模型中增加最顯著的信號。免疫組化染色證實，APC模型髁突的軟骨細胞和免疫細胞中TNF-α高表達，而在UAC模型中則不那么高。

單細胞轉錄組分析表明，在穩態下，流出的TNF信號主要來源于巨噬細胞，而在APC模型髁突中，該信號大幅增加且主要來源于II期中性粒細胞，與其它免疫細胞和軟骨細胞的潛在相互作用增強。免疫熒光顯示APC模型中軟骨細胞、MPO⁺中性粒細胞和CD68⁺巨噬細胞的TNF-α產生顯著增加。在UAC模型中大幅增加的流出BSP信號，則主要來源于Col10a1^high肥大軟骨細胞、礦化相關軟骨細胞和成熟軟骨細胞。信號分析表明，Thbs1-Sdc4和Col2a1信號在介導I/II期中性粒細胞-軟骨細胞相互作用中占主導地位，在UAC模型中從中性粒細胞流向軟骨細胞的這些信號輸出比健康對照組強得多。Col2a1信號在軟骨細胞間的增強多于中性粒細胞-軟骨細胞相互作用。免疫熒光顯示，UAC模型髁突中從軟骨到軟骨下骨存在廣泛的BSP陽性區域，在骨骼和骨軟骨連接區域具有高免疫反應性，這些區域與內皮標志物CD31的表達共定位。

與軟骨層排列有序、完整性好的健康髁突軟骨相比，APC或UAC誘導的病變表現為軟骨層厚度顯著減少，改良Mankin評分評估的骨關節炎嚴重程度加劇。給予TNF-α抑制劑依那西普（Etanercept）可顯著改善APC模型誘導的軟骨損傷，但對UAC模型小鼠的保護作用不明顯。CXCR2/CXCR1抑制劑那伐蘆新（Navarixin）可減輕UAC模型誘導的骨關節炎，但對APC模型引起的髁突病變無統計學顯著影響。

本研究首次揭示了小鼠TMJ髁突軟骨細胞的轉錄組異質性。通過健康-疾病的比較，在單細胞分辨率下為TMJ髁突的穩態和TMJOA的發病機制提供了見解。研究發現，Mmp13^high軟骨細胞、Col1a1^high軟骨細胞和Col10a1^high軟骨細胞是不同的細胞簇。表達MMP13或骨鈣素的軟骨細胞主要位于增殖區而非肥大區。具有肥大形態、位于深層的Collagen-X^high軟骨細胞部分而非全部對MMP13或骨鈣素呈陽性。與空間關系暗示的發育順序一致，偽時間分析表明Mmp13^high軟骨細胞、Col1a1^highBglap^highIfitm5^high礦化相關軟骨細胞處于成熟軟骨細胞之前的階段，而Col1a1^high軟骨細胞處于軌跡末端。這些發現表明，在TMJ髁突中，軟骨細胞在增殖早期就具有礦化特征。Collagen-X而非MMP13或骨鈣素，可作為肥大軟骨細胞的標志物。

與其它關節軟骨的單細胞圖譜一致，本研究在髁突淺層鑒定出STMN1^highBIRC5^highDHFR^high軟骨細胞祖細胞，這些細胞也可稱為“增殖軟骨細胞”。在TMJ髁突中，一個S100A4^highABI3BP^high的“纖維化軟骨細胞”群體被鑒定出來，位于軟骨淺層，沿偽時間軌跡位于軟骨細胞祖細胞之后。一個NOS2^high軟骨細胞群體以促炎表型為特征，被鑒定位于淺層下方，沿偽時間軌跡位于纖維化軟骨細胞之后。值得注意的是，穩態下軟骨細胞簇有序排列的空間關系和偽時間軌跡，被咬合紊亂誘導的TMJOA顯著打亂。病變髁突顯示出紊亂的偽時間軌跡和被侵蝕軟骨層中雜亂擠壓的細胞。這些結果突顯了TMJ髁突軟骨細胞相對于其它關節獨特的轉錄譜，并提示軟骨細胞發育軌跡可能參與了TMJOA的發病機制。

單細胞轉錄組分析揭示了UAC模型髁突中潛在的BSP信號增強。既往研究支持BSP作為骨形成、骨折愈合和骨關節炎病理中血管生成的關鍵介質，這與本研究發現BSP免疫反應區域與血管生成標志物CD31共定位的結果一致。骨軟骨連接處的新生血管形成是TMJOA的一個重要致病特征。新血管侵入軟骨，促進軟骨細胞肥大和基質礦化。軟骨內血管生成， coupled with neoneurogenesis，會加劇疼痛并促進軟骨骨化。本研究的組織學檢查和scRNA-seq分析提示血管生成是UAC誘導的TMJOA的主要致病因素之一。考慮到Thbs1-Sdc4信號的促血管生成作用，血管侵入后免疫細胞浸潤增加可能通過促進正反饋環路加劇軟骨侵蝕。增強的Thbs1-Sdc4信號被發現是UAC擾亂的軟骨細胞-免疫細胞相互作用中的主導變化，突顯了血管生成在UAC誘導的發病機制中的關鍵作用。因此，通過給予CXCR2/CXCR1抑制劑那伐蘆新靶向中性粒細胞浸潤，試圖阻斷這一致病過程，結果髁突軟骨損傷被顯著減輕，但遠未完全恢復正常。治療效果的限制可能源于多種機制。

TMJOA難以治療的原因之一是其發病機制涉及遺傳、機械和生化等多種因素。不同的病因可能對應著不同的致病機制。目前通過制造咬合紊亂、關節內注射炎癥介質、基因修飾或手術操作（如關節盤部分穿孔）來建立TMJOA動物模型。盡管成功誘導了OA樣病變，但這些模型在模擬OA可能由單一或多種病因學因素組合導致的復雜臨床情況方面仍顯不足。UAC和咬合抬高模型基于關節負荷過載或不平衡導致機械刺激從而誘發和加重TMJOA的認知，被用于模擬TMJOA。本研究中，兩個模型間轉錄組推斷的免疫-軟骨細胞互作機制的差異表明，TMJOA的發病機制可能高度依賴于具體情境，而不是由特定模型揭示的機制所能代表。即使是咬合負荷誘導的TMJOA，也因咬合紊亂類型不同而涉及不同的發病機制，因此針對發病機制的治療應相應調整。然而，由于轉錄組數據固有的局限性，本研究的功能意義需謹慎解讀。scRNA-seq數據推斷的是由配體-受體共表達模式介導的潛在細胞間通訊，而非提供驗證功能性結合事件所必需的蛋白質-蛋白質相互作用的直接證據。需要進一步研究優先進行功能驗證，以將觀察性發現轉化為可操作的治療策略。

既往對人類TMJOA髁突的研究鑒定出類似的免疫細胞類型和具有不同功能富集的軟骨細胞簇。然而，由于缺乏健康對照以及人類樣本TMJOA病因學信息缺失，關于致病機制的比較有限。本研究結果不能直接外推至人類疾病，因為小鼠和人類的TMJ在解剖和病理上存在差異。然而，本研究證明了TMJOA發病機制的高度復雜性，且可能因不同病因學因素而異。TMJOA的致病機制和靶向治療或許更適合基于特定的病因學條件來闡述，而非普遍適用。在人體組織中進行疾病-健康比較的進一步研究將具有重要意義。

動物實驗經四川大學華西口腔醫學院倫理委員會批準。使用90只4周齡雌性C57BL/6小鼠，平均分為三組：健康對照組、APC模型組和UAC模型組。APC模型通過在上切牙腭側粘接樹脂斜面構建，UAC模型通過在左上頜和下頜切牙上粘接一對不銹鋼管構建，迫使小鼠下頜左移。實驗終點為4周。為檢驗靶向信號通路給藥對APC或UAC誘導的小鼠TMJOA的治療效果，另使用42只小鼠，平均分為七組。依那西普通過腹腔注射給藥，那伐蘆新同樣經腹腔注射給藥。實驗終點收取下頜骨進行組織學檢查。

從髁突解剖出關節軟骨組織，用膠原酶Ⅱ和胰蛋白酶解離，制備單細胞懸液。使用SeekOne? MM單細胞3’文庫制備試劑盒構建scRNA-seq文庫，在Illumina NovaSeq 6000平臺上進行PE150測序。使用Seurat軟件包進行數據質量控制、整合、降維和聚類分析。對細胞簇進行注釋，并進行基因本體富集分析、偽時間軌跡分析和細胞-細胞通訊分析。對下頜骨樣本進行石蠟包埋切片，進行H&E染色、Masson染色、番紅O-固綠染色以及多重免疫熒光染色。使用Image J測量軟骨厚度并評估改良Mankin評分。scRNA-seq數據的統計分析使用R軟件，免疫化學半定量數據使用GraphPad Prism軟件分析，組間差異采用單因素方差分析及Sidak多重比較檢驗，P值小于0.05認為具有統計學顯著性。