《Neuroscience & Biobehavioral Reviews》：Plasmin contributes to arthritis pain by Cleaving proteinase activated Receptor-4 in rats
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關(guān)節(jié)疼痛機(jī)制是關(guān)節(jié)炎治療中的關(guān)鍵難題，當(dāng)前藥物療法常伴隨副作用且療效有限。本文針對纖溶酶(PI)是否通過激活蛋白酶激活受體4(PAR-4)驅(qū)動關(guān)節(jié)炎疼痛這一科學(xué)問題展開研究，通過在大鼠模型中局部注射纖溶酶、使用PAR-4拮抗劑pepducin P4pal10和纖溶酶抑制劑神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑(neuroserpin)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)纖溶酶的確通過激活關(guān)節(jié)內(nèi)的PAR-4受體引發(fā)疼痛行為，而抑制纖溶酶活性可緩解急性關(guān)節(jié)炎疼痛。該研究首次揭示了纖溶酶-PAR-4通路在關(guān)節(jié)炎疼痛中的作用，為開發(fā)靶向該通路的新型鎮(zhèn)痛策略提供了實驗依據(jù)。
關(guān)節(jié)炎是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致長期殘疾的主要原因，其引發(fā)的疼痛復(fù)雜，涉及傷害性、炎癥性和神經(jīng)病理性成分。盡管針對關(guān)節(jié)炎疼痛的介質(zhì)和通路已有大量研究，但目前的鎮(zhèn)痛選擇仍然有限。長期使用對乙酰氨基酚和非甾體抗炎藥可能導(dǎo)致胃腸道和心血管并發(fā)癥，而生物制劑則與全身性感染和療效遞減相關(guān)。因此，尋找既能干預(yù)關(guān)節(jié)退變又能緩解癥狀的新靶點，成為治療關(guān)節(jié)炎的迫切需求。絲氨酸蛋白酶是關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中水平升高的一類蛋白水解酶，除導(dǎo)致組織損傷外，還能通過作用于一組稱為蛋白酶激活受體(PARs)的G蛋白偶聯(lián)受體來傳遞疼痛信號。其中，PAR-4的激活已被發(fā)現(xiàn)能使關(guān)節(jié)傷害感受器敏化，從而產(chǎn)生疼痛。然而，在關(guān)節(jié)中負(fù)責(zé)激活PAR-4的蛋白酶身份尚不明確。纖溶酶作為一種絲氨酸蛋白酶，其在類風(fēng)濕性和骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中的生物活性升高，不僅能降解關(guān)節(jié)組織，還能裂解PAR-4。那么，纖溶酶是否通過激活PAR-4來介導(dǎo)關(guān)節(jié)疼痛？其內(nèi)源性抑制劑神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑(neuroserpin)又能否緩解疼痛？為解答這些問題，Jason J. McDougall在《Neuroscience》上發(fā)表了其研究成果。
本研究主要運用了以下幾項關(guān)鍵技術(shù)方法：使用雄性Wistar大鼠作為動物模型；通過馮弗雷毛發(fā)(Von Frey hair)機(jī)械刺激法評估后爪機(jī)械敏感性，計算50%縮足閾值；使用動態(tài)后肢負(fù)重測試系統(tǒng)，在清醒自由活動的動物中測量雙側(cè)后肢的承重分布；通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射纖溶酶(劑量為0.04U, 0.1U, 0.4U)誘導(dǎo)疼痛，并使用PAR-4拮抗劑pepducin P4pal10(100μg，腹腔注射)和纖溶酶抑制劑神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑(3μg，膝關(guān)節(jié)局部皮下注射)進(jìn)行藥理學(xué)干預(yù)；此外，還建立了高嶺土/角叉菜膠誘導(dǎo)的急性滑膜炎模型，并在誘導(dǎo)前局部注射神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行預(yù)防性治療評估。
3.1. 纖溶酶對后爪縮足閾值和負(fù)重的影響
關(guān)節(jié)內(nèi)注射纖溶酶可劑量依賴性地降低大鼠后爪的馮弗雷毛發(fā)機(jī)械刺激閾值，并減少同側(cè)后肢的承重比例，最大效應(yīng)出現(xiàn)在注射后120分鐘，其中0.4U劑量的纖溶酶效果最顯著。這表明確實可引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛行為。
3.2. PAR-4阻斷和神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑對纖溶酶誘導(dǎo)關(guān)節(jié)疼痛的影響
提前給予PAR-4受體拮抗劑pepducin P4pal10，能夠顯著減弱纖溶酶誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏和負(fù)重缺陷。這證明纖溶酶產(chǎn)生的疼痛依賴于PAR-4的激活。局部給予神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑也能逆轉(zhuǎn)纖溶酶引起的觸覺超敏反應(yīng)，但對后肢承重缺陷無顯著影響。這表明抑制纖溶酶活性可以緩解其部分致痛效應(yīng)。
3.3. 神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑在急性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中的鎮(zhèn)痛作用
在高嶺土/角叉菜膠誘導(dǎo)的急性滑膜炎模型中，預(yù)防性給予神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠改善模型動物的后爪機(jī)械痛閾，但對關(guān)節(jié)功能障礙（后肢承重）沒有影響。這提示在急性炎癥狀態(tài)下，抑制纖溶酶活性具有一定的鎮(zhèn)痛潛力。
本研究首次證明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射外源性纖溶酶可通過激活關(guān)節(jié)PAR-4受體，導(dǎo)致后爪機(jī)械閾值降低和疼痛行為。同時，使用內(nèi)源性酶抑制劑神經(jīng)絲氨酸蛋白酶進(jìn)行預(yù)防性治療，可以阻斷纖溶酶的致痛作用，并減輕急性炎癥性關(guān)節(jié)疼痛。已知約60%的膝關(guān)節(jié)傳入神經(jīng)表達(dá)PAR-4，選擇性激活該受體會導(dǎo)致外周敏化和疼痛。本研究發(fā)現(xiàn)纖溶酶產(chǎn)生的劑量依賴性疼痛反應(yīng)可被pepducin P4pal10阻斷，這直接證實了纖溶酶-PAR-4通路在關(guān)節(jié)疼痛中的作用。神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，其作用在于限制包括纖溶酶在內(nèi)的某些酶的神經(jīng)元活性。本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠阻斷纖溶酶的致痛作用，證實了該抑制劑通過作用于這一蛋白水解通路來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而，神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑并未改變由纖溶酶治療或急性滑膜炎引起的后肢承重變化，這可能暗示其作用部位在中樞。盡管神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑是關(guān)節(jié)局部皮下給藥，但它可能進(jìn)入體循環(huán)，從而減弱脊髓背角的神經(jīng)元活動。這一潛在機(jī)制得到了以下觀察結(jié)果的支持：神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑提高了后爪撤回閾值，而這正是膝關(guān)節(jié)疼痛研究中中樞敏化的一個測量指標(biāo)。綜上所述，纖溶酶通過裂解PAR-4導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎疼痛，而阻斷纖溶酶-PAR-4通路（例如使用神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑）為緩解膝關(guān)節(jié)疼痛提供了一個有前景的新靶點。
