白色念珠菌(Candida albicans)是一種常見于人體消化道、泌尿系統(tǒng)等生態(tài)位點(diǎn)的致病真菌，通常在免疫系統(tǒng)減弱或黏膜受損時(shí)引發(fā)感染。其致病性與形態(tài)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，能夠在酵母、假菌絲和真菌絲形態(tài)間切換。其中，菌絲形態(tài)在組織穿透、免疫逃逸和加劇系統(tǒng)性感染中起關(guān)鍵作用。然而，直接干預(yù)三種形態(tài)間轉(zhuǎn)換的藥物靶點(diǎn)尚未明確，驅(qū)動(dòng)形態(tài)轉(zhuǎn)換的確切機(jī)制也未完全解析。本研究聚焦于乙醇脫氫酶I(Adh1)，該酶不僅參與糖酵解等基礎(chǔ)代謝，此前也被發(fā)現(xiàn)與真菌毒力增強(qiáng)、耐藥性形成和免疫逃逸過程密切相關(guān)。研究旨在闡明Adh1在白色念珠菌多態(tài)性轉(zhuǎn)換中的具體功能和機(jī)制，并嘗試從天然產(chǎn)物中篩選靶向Adh1、影響多態(tài)性的先導(dǎo)分子。

生物膜為白色念珠菌提供了穩(wěn)定的保護(hù)性生態(tài)，是復(fù)發(fā)性念珠菌感染的主要原因。成熟的生物膜構(gòu)建包括黏附、萌芽、成熟和分散四個(gè)階段，其中菌絲形成是侵襲性感染的核心環(huán)節(jié)。通過同源重組策略構(gòu)建^ADH1敲除株和^ADH1基因過表達(dá)株后發(fā)現(xiàn)，高水平的Adh1抑制了菌絲在Spider培養(yǎng)基表面的延伸或向培養(yǎng)基內(nèi)部的擴(kuò)展。相反，^ADH1的缺失促使真菌分化為真菌絲并更深入地侵入瓊脂。與此表型一致，白色念珠菌菌絲相關(guān)基因（包括^ECE1、^HWP1、^BCR1和^TEC1）的mRNA水平也隨Adh1表達(dá)量的改變而變化。因此，白色念珠菌Adh1是真菌絲形成的有效抑制因子，賦予了菌株在生物膜誘導(dǎo)條件下充足的多態(tài)性靈活性。

基于野生型和^ADH1敲除白色念珠菌成熟生物膜的定量分析，研究篩選了一個(gè)涵蓋多種類型化合物的天然產(chǎn)物庫(kù)。考慮到藥物作用的靶點(diǎn)依賴性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)靶點(diǎn)缺失時(shí)，化合物的藥效預(yù)期會(huì)發(fā)生改變。因此，監(jiān)測(cè)天然產(chǎn)物在^ADH1缺失前后對(duì)生物膜抑制率的變化是鑒定Adh1功能調(diào)節(jié)劑的關(guān)鍵策略。對(duì)114種天然產(chǎn)物的初篩鑒定出15個(gè)優(yōu)先抑制野生型而非^ADH1-KO生物膜的候選物。其中，蒽醌類是最富集的類別。檢測(cè)結(jié)果表明，蒽醌類化合物如1,4-萘醌、2-甲基蒽醌、蘆薈大黃素和2-羥基蒽醌(HAQ)在^ADH1缺失后顯示出生物膜抑制作用的顯著降低。其中，HAQ和1,4-萘醌表現(xiàn)出最優(yōu)異的活性，在40 μg/mL濃度下分別將總生物膜生物量下調(diào)97.3%和71.8%。值得注意的是，高濃度的HAQ未對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著抑制，這與^ADH1不參與菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)調(diào)控的事實(shí)相符。最終，研究檢測(cè)了HAQ發(fā)揮生物膜抑制作用的Adh1依賴性。與對(duì)照組相比，敲除^ADH1削弱了HAQ對(duì)成熟生物膜形成的限制作用，此時(shí)HAQ無法阻止生物膜內(nèi)菌絲發(fā)育為真菌絲。相反，過表達(dá)^ADH1是HAQ抑制活性的有效貢獻(xiàn)因素，表明Adh1是HAQ的藥理學(xué)靶點(diǎn)。綜上所述，HAQ通過Adh1抑制白色念珠菌生物膜內(nèi)的菌絲發(fā)育。

本研究通過將白色念珠菌的全蛋白溶液流經(jīng)固定了蒽醌化合物大黃素的環(huán)氧活化層析柱，捕獲能與蒽醌類相互作用的蛋白，隨后用HAQ溶液競(jìng)爭(zhēng)性洗脫HAQ特異性結(jié)合蛋白。在質(zhì)譜鑒定結(jié)果中，根據(jù)MaxQuant評(píng)分大于50作為合理性標(biāo)準(zhǔn)，豐度最高的三種蛋白是轉(zhuǎn)錄因子Tup1、烯醇化酶Eno1和乙醇脫氫酶Adh1。這些結(jié)果表明上述三種蛋白都可能與HAQ相互作用。由于質(zhì)譜無法表征直接的化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合，研究隨后進(jìn)行了分子對(duì)接模擬和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Tup1和Adh1能夠以穩(wěn)定的構(gòu)象與HAQ結(jié)合，結(jié)合能分別為-8.5 Kcal/mol和-8.0 Kcal/mol。考慮到Adh1也是本研究的焦點(diǎn)和HAQ的功能靶點(diǎn)，Adh1被初步鑒定為HAQ抑制生物膜的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)。

通過異源表達(dá)獲得重組Adh1后，在體外驗(yàn)證了HAQ與Adh1的相互作用。在差示掃描熒光法中，HAQ的存在導(dǎo)致Adh1在溫度梯度場(chǎng)中僅顯示一個(gè)熔解溫度，且Tm值隨藥物濃度增加而升高。同樣，在色氨酸熒光光譜實(shí)驗(yàn)中，隨著體系中HAQ濃度的升高，色氨酸發(fā)射熒光的波長(zhǎng)逐漸紅移。上述結(jié)果表明，與HAQ共孵育不僅增強(qiáng)了Adh1中色氨酸周圍環(huán)境的極性，還提高了Adh1的熱穩(wěn)定性，二者之間存在直接相互作用。隨后通過微量熱泳動(dòng)評(píng)估二者親和力，擬合得到親和力大小為111.86 μM。最后，基于核糖體A位點(diǎn)抑制劑茴香霉素阻斷白色念珠菌內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯，發(fā)現(xiàn)在菌絲誘導(dǎo)環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)Adh1水平會(huì)隨時(shí)間推移而降低。相比之下，在相同條件下，真菌培養(yǎng)物與HAQ共孵育可防止通常在菌絲誘導(dǎo)環(huán)境中發(fā)生的Adh1降解，使蛋白質(zhì)水平保持穩(wěn)定。這一結(jié)果意味著進(jìn)入白色念珠菌的HAQ會(huì)直接與Adh1相互作用并增強(qiáng)其穩(wěn)定性。綜上所述，白色念珠菌Adh1是HAQ的直接靶點(diǎn)。

為深入分析化合物-蛋白質(zhì)相互作用，通過分子對(duì)接模擬了HAQ與Adh1的直接結(jié)合構(gòu)象。結(jié)果顯示，Adh1中共有11個(gè)氨基酸可能與HAQ結(jié)合。其中，化合物通過羰基和羥基與G180、S179和Q257形成共價(jià)氫鍵，并通過增稠的三取代苯環(huán)分別與F224和A254形成π-π共軛和σ-π超共軛。接下來，選取前10個(gè)對(duì)接構(gòu)象并統(tǒng)計(jì)11個(gè)相互作用氨基酸的出現(xiàn)頻率，F(xiàn)224和A254出現(xiàn)頻率最高，其次是S179、Q257、G180、S249。為驗(yàn)證上述位點(diǎn)，以F224和A254為分割點(diǎn)，構(gòu)建了一系列^ADH1異源表達(dá)載體，獲得在潛在HAQ結(jié)合氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變的Adh1。在此基礎(chǔ)上，使用微量熱泳動(dòng)檢測(cè)了HAQ與Adh1突變體的相互作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)224A導(dǎo)致Adh1與HAQ的結(jié)合無法檢測(cè)到。與野生型Adh1相比，A254T和Q257A導(dǎo)致Adh1對(duì)HAQ的親和力顯著下降，親和常數(shù)分別為528.48和4990 μM。相比之下，其余突變形式僅表現(xiàn)出相對(duì)溫和的影響。上述結(jié)果表明，Adh1的F224、A254和Q257對(duì)于HAQ與Adh1的結(jié)合至關(guān)重要。

為分析Adh1調(diào)控白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，本研究利用親和純化-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，系統(tǒng)比較了HAQ和DMSO處理?xiàng)l件下Adh1相互作用的蛋白質(zhì)組差異。通過整合生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)挖掘，發(fā)現(xiàn)Adh1特異性共富集了真菌碳代謝核心調(diào)節(jié)因子SNF1激酶以及調(diào)控SNF1去磷酸化的關(guān)鍵復(fù)合體組分，而HAQ顯著降低了這些調(diào)節(jié)元件與Adh1相互作用的強(qiáng)度。這暗示Adh1可能通過與真菌生物膜形成相關(guān)的SNF1信號(hào)通路來阻斷真菌絲發(fā)育，而HAQ則通過靶向破壞Adh1-SNF1復(fù)合物的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)SNF1信號(hào)通路的激活。

為闡明Adh1對(duì)SNF1磷酸化的調(diào)節(jié)作用，通過過表達(dá)和敲除^ADH1進(jìn)行了系統(tǒng)的功能驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在生物膜誘導(dǎo)條件下，^ADH1敲除菌株的SNF1磷酸化水平與野生型和過表達(dá)菌株相比顯著升高，證實(shí)Adh1是SNF1活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。為闡明分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，本研究在釀酒酵母BJ5464-NpgA中構(gòu)建了His-Adh1和Flag-Bmh1/Flag-Ssb1共表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)HAQ特異性地削弱了Adh1與SNF1去磷酸化調(diào)節(jié)元件（包括Bmh1和Ssb1）的結(jié)合強(qiáng)度。值得注意的是，HAQ以劑量依賴的方式顯著降低了SNF1磷酸化水平，且這種效應(yīng)在^ADH1缺陷菌株中顯著減弱，表明Adh1是藥物作用不可或缺的靶分子。總之，HAQ通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制Adh1與SNF1磷酸酶調(diào)節(jié)復(fù)合物的結(jié)合，以Adh1依賴的方式阻斷了SNF1信號(hào)通路的激活，從而精確調(diào)控真菌形態(tài)轉(zhuǎn)換過程。

Sak1是白色念珠菌中唯一的專一性SNF1激活激酶。為考察SNF1磷酸化對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株CBS562菌絲形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)作用，研究敲除了^SAK1。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，^SAK1敲除菌株維持了極低的磷酸化水平。在Spider固體培養(yǎng)基和RPMI-1640（含10% FBS）液體培養(yǎng)基中，SNF1磷酸化缺陷的機(jī)體無法形成用于滲透延伸和三維空間結(jié)構(gòu)組織的菌絲。此時(shí)，生物膜僅由酵母型細(xì)胞簡(jiǎn)單串聯(lián)堆疊而成。與表型一致，^SAK1敲除后菌絲相關(guān)基因的表達(dá)也顯著下降，表明當(dāng)細(xì)胞內(nèi)SNF1處于低水平磷酸化狀態(tài)時(shí)，菌株無法進(jìn)展為菌絲形態(tài)，從而穩(wěn)定保持在酵母形態(tài)。在結(jié)晶紫染色定量結(jié)果中，雖然^SAK1敲除未顯著影響成熟生物膜的生物量，但HAQ的生物膜抑制效應(yīng)隨之降低。同時(shí)，HAQ無法對(duì)受阻的酵母或假菌絲形態(tài)進(jìn)行大幅度的形態(tài)學(xué)調(diào)整，這表明HAQ可能借助SNF1信號(hào)通路來限制菌絲形成，從而發(fā)揮生物膜抑制作用。

接下來，為探究SNF1信號(hào)通路與HAQ或Adh1在表型調(diào)節(jié)中的關(guān)系，使用激活劑上調(diào)SNF1磷酸化水平，以進(jìn)一步確認(rèn)HAQ或Adh1依賴SNF1發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果顯示，以劑量依賴方式促進(jìn)SNF1磷酸化的Dorsomorphin，顯著下調(diào)了白色念珠菌成熟生物膜的生物量，并在^ADH1敲除菌株中表現(xiàn)出增強(qiáng)的效力。考慮到預(yù)實(shí)驗(yàn)中^ADH1敲除會(huì)在生物膜誘導(dǎo)條件下刺激SNF1激活，推測(cè)SNF1磷酸化高水平的疊加可能會(huì)限制菌株在生物膜構(gòu)建周期中的形態(tài)可塑性。這些發(fā)現(xiàn)表明，升高的SNF1磷酸化在誘導(dǎo)白色念珠菌菌絲過度延伸的同時(shí)，損害了其形成分支菌絲和進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換的能力，而這些能力是生物膜組裝所必需的。因此，盡管SNF1磷酸化促進(jìn)了菌絲延伸，但它同時(shí)抑制了生物膜形成。此外，Dorsomorphin促進(jìn)野生型和^ADH1過表達(dá)白色念珠菌發(fā)育為真菌絲，且形態(tài)趨于一致。因此提示，與野生型菌株生物膜內(nèi)的假菌絲相比，由^ADH1敲除或激活劑刺激介導(dǎo)的高水平SNF1磷酸化將促進(jìn)菌株向真菌絲發(fā)育。當(dāng)SNF1磷酸化水平維持在恒定狀態(tài)時(shí)，Adh1無法在此基礎(chǔ)上對(duì)菌絲形態(tài)做出某些調(diào)整，這表明Adh1是通過調(diào)節(jié)SNF1磷酸化來發(fā)揮表型調(diào)節(jié)效應(yīng)的。由于^ADH1敲除菌株的生物膜生物量在高濃度Dorsomorphin中過低，表征其菌絲形態(tài)不可行。最后，在生物膜誘導(dǎo)條件下，用Dorsomorphin和HAQ共同處理菌株。結(jié)果顯示，兩種藥物協(xié)同抑制生物膜形成。在這種情況下，共處理組的真菌表現(xiàn)出真菌絲形態(tài)。也就是說，當(dāng)體系中存在Dorsomorphin時(shí)，HAQ無法發(fā)揮顯著的菌絲形成抑制作用。上述結(jié)果表明，HAQ通過促進(jìn)SNF1去磷酸化從而下調(diào)SNF1磷酸化水平，將白色念珠菌阻滯在酵母形態(tài)。總之，HAQ通過Adh1-SNF1信號(hào)通路緩解白色念珠菌的絲狀化。

表型可塑性是白色念珠菌最典型的致病特征，由不同形態(tài)細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成的生物膜是臨床耐藥性念珠菌病的主要挑戰(zhàn)。本研究關(guān)注了與致病性相關(guān)的白色念珠菌多功能糖酵解酶Adh1。現(xiàn)有研究表明，該酶通過醇-醛代謝調(diào)節(jié)黏附、菌絲發(fā)育和生物膜形成等毒力過程，但其具體效應(yīng)或機(jī)制尚無定論。因此，研究敲除或過表達(dá)了實(shí)驗(yàn)菌株CBS562的^ADH1基因。與文獻(xiàn)報(bào)道的^ADH1敲除破壞臨床標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314菌絲發(fā)育不同，CBS562反而因敲除形成了過度延伸的菌絲。觀察發(fā)現(xiàn)，CBS562形成的生物膜內(nèi)菌絲主要以假菌絲形式存在，周圍散布大量酵母型細(xì)胞，表明CBS562具有更強(qiáng)的多態(tài)性。在此基礎(chǔ)上，敲除^ADH1介導(dǎo)假菌絲進(jìn)一步延伸為過度伸長(zhǎng)的真菌絲，而過表達(dá)^ADH1則促進(jìn)菌株向酵母狀態(tài)轉(zhuǎn)換。CBS562表現(xiàn)出的靈活性為理解Adh1在多態(tài)性調(diào)控中的功能提供了機(jī)會(huì)。

基于靶點(diǎn)的藥物發(fā)現(xiàn)是新藥開發(fā)的常見策略。本研究基于野生型和^ADH1敲除菌株的生物膜模型，發(fā)現(xiàn)蒽醌類化合物通過Adh1發(fā)揮對(duì)白色念珠菌的生物膜抑制作用。盡管先前研究中關(guān)于活性蒽醌類的報(bào)道僅限于生物膜表型或特定基因表達(dá)，本研究嘗試從化合物靶點(diǎn)角度探索其作用機(jī)制。在四種以Adh1為功能靶點(diǎn)的蒽醌類化合物中，只有HAQ能夠在不影響白色念珠菌生長(zhǎng)的情況下發(fā)揮最顯著的生物膜抑制活性。考慮到^ADH1的敲除或過表達(dá)也不影響菌株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，HAQ被認(rèn)為是調(diào)節(jié)Adh1、從而調(diào)整菌絲形態(tài)方向最合理的調(diào)節(jié)劑。隨后，研究反向探索了HAQ的靶蛋白。將活性低得多的大黃素作為弱結(jié)合藥物固定在環(huán)氧活化瓊脂糖微球中，然后用HAQ競(jìng)爭(zhēng)性洗脫蛋白。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示靶蛋白Adh1獲得高分。隨后的差示掃描熒光法和微量熱泳動(dòng)等實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了HAQ與Adh1的直接相互作用。

接下來，通過將親和純化與質(zhì)譜檢測(cè)耦聯(lián)，檢測(cè)了受HAQ影響的Adh1相互作用蛋白，以探索Adh1調(diào)控白色念珠菌生物膜菌絲形成的下游信號(hào)。在以往研究中，具有白色念珠菌生物膜或菌絲抑制功能的蒽醌類化合物常表現(xiàn)出調(diào)節(jié)糖酵解或三羧酸循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)、抑制代謝等活性。類似地，刪除^ADH1在抑制生物膜的同時(shí)，也調(diào)節(jié)真菌內(nèi)的線粒體代謝和ATP產(chǎn)生。因此，在質(zhì)譜數(shù)據(jù)中重點(diǎn)關(guān)注了與能量代謝相關(guān)的SNF1及其多個(gè)去磷酸化調(diào)節(jié)因子。研究表明，SNF1參與釀酒酵母生物膜形成的調(diào)節(jié)。在過量葡萄糖刺激下，SNF1失活將介導(dǎo)DNA結(jié)合蛋白Mig1易位至細(xì)胞核，阻止替代能量利用基因的表達(dá)，并通過與Tup1、Ssn6等結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)絮凝相關(guān)蛋白Flo11的水平，最終拮抗生物膜形成。此外，菌絲生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子Nrg1和Nrg2也可以作為SNF1激酶的直接或間接靶點(diǎn)，從而參與釀酒酵母的菌絲分化和侵襲性生長(zhǎng)。這暗示SNF1是Adh1調(diào)節(jié)白色念珠菌生物膜形成的潛在效應(yīng)分子。由于缺乏市售的特異性靶向白色念珠菌蛋白的抗體，研究通過在釀酒酵母中表達(dá)帶His或Flag標(biāo)簽的蛋白，通過Co-IP復(fù)核質(zhì)譜信息，在此強(qiáng)調(diào)了HAQ下調(diào)Adh1與Ssb1或Bmh1相互作用的現(xiàn)象。值得注意的是，現(xiàn)有線索不足以解釋HAQ以及Adh1在調(diào)節(jié)SNF1磷酸化方面的機(jī)制。關(guān)于Adh1是否借助Ssb1和Bmh1調(diào)節(jié)SNF1活性，以及HAQ是否通過調(diào)節(jié)Adh1與Ssb1或Bmh1的相互作用來影響SNF1激活，需要通過干預(yù)Adh1與調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用來進(jìn)一步證實(shí)。在SNF1磷酸化檢測(cè)結(jié)果中，Adh1緩解了白色念珠菌SNF1的激活。當(dāng)^ADH1被敲除時(shí)，SNF1在生物膜誘導(dǎo)條件下維持高水平的磷酸化。此外，HAQ不僅下調(diào)了Adh1與SNF1去磷酸化調(diào)節(jié)因子之間的相互作用，而且還依賴Adh1發(fā)揮SNF1磷酸化抑制劑的功能。這一結(jié)果同樣為Adh1參與SNF1磷酸化調(diào)節(jié)提供了更充分的證據(jù)。

在白色念珠菌SNF1磷酸化檢測(cè)結(jié)果中觀察到了兩條免疫印跡條帶。Lambda蛋白磷酸酶處理實(shí)驗(yàn)證明，觀察到的兩條條帶都是SNF1特異的磷酸化形式。敲除^SAK1使下方條帶減弱至野生型的15%，因此用該條帶來表征SNF1磷酸化。研究意外發(fā)現(xiàn)，常用的AMPK抑制劑Dorsomorphin以劑量依賴的方式促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)菌株中SNF1的磷酸化。考慮到Dorsomorphin促進(jìn)野生型和^ADH1過表達(dá)菌株發(fā)育為真菌絲，同時(shí)限制了HAQ和Adh1對(duì)菌絲形態(tài)的調(diào)節(jié)，而^SAK1敲除菌株僅呈現(xiàn)酵母樣狀態(tài)，且由^ADH1敲除引起的高水平SNF1磷酸化同樣介導(dǎo)菌株形成真菌絲，因此得出結(jié)論：白色念珠菌生物膜內(nèi)機(jī)體的形態(tài)直接受SNF1磷酸化程度控制，而HAQ和Adh1借助SNF1磷酸化來調(diào)節(jié)菌絲形成。Dorsomorphin促進(jìn)白色念珠菌SNF1磷酸化的免疫印跡結(jié)果在此得到確認(rèn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的差異歸因于物種間代謝調(diào)節(jié)的差異。由于Dorsomorphin在SNF1磷酸化Western印跡實(shí)驗(yàn)中抑制上方條帶磷酸化的同時(shí)促進(jìn)下方條帶磷酸化，推測(cè)Dorsomorphin可能優(yōu)先抑制負(fù)責(zé)上方條帶（其他位點(diǎn)）磷酸化的激酶。這種抑制可能導(dǎo)致磷酸基團(tuán)或激酶對(duì)Thr208位點(diǎn)的可用性相對(duì)增加，在我們的檢測(cè)中表現(xiàn)為對(duì)功能性（下方條帶）磷酸化的明顯整體促進(jìn)。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，促進(jìn)SNF1去磷酸化的HAQ抑制菌絲延伸，而增強(qiáng)SNF1磷酸化的Dorsomorphin則誘導(dǎo)菌絲過度延伸。這些結(jié)果與SNF1磷酸化促進(jìn)菌絲延伸的假設(shè)一致。然而，HAQ和Dorsomorphin在生物膜形成上表現(xiàn)出協(xié)同抑制效應(yīng)。這種現(xiàn)象可能歸因于完整的菌絲多態(tài)性是生物膜正常發(fā)育所必需的。