《Plant Pathology Journal》：The Changing Landscape of Root-Knot Nematodes in Brazilian Soybean Fields: Shifting Prevalence of Meloidogyne arenaria, M. incognita and M. javanica and the Occurrence of an Emerging Species, M. enterolobii
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本研究通過整合生化和分子生物學方法，對巴西中南部10個州344個大豆田進行了大規模調查，揭示了根結線蟲(Meloidogyne spp., RKN)物種組成在過去二十年的顯著變遷。首次在巴西中南部商業大豆田中檢測到高致病性外來種象耳豆根結線蟲(M. enterolobii)，并在44%的受侵染田間發現多種線蟲混合發生。研究發現南方根結線蟲(M. incognita)在馬托格羅索和戈亞斯州占主導，而爪哇根結線蟲(M. javanica)在南部各州更為普遍。線粒體基因NADH5被證實是區分這三個近緣種最有效的分子標記。這些結果為巴西大豆生產的線蟲綜合管理策略制定提供了關鍵的科學依據。
引言
根結線蟲（Root-knot nematodes, RKN），屬于根結線蟲屬（Meloidogyne），是全球范圍內最具經濟破壞性的植物寄生性線蟲之一，對包括大豆（Glycine max）在內的多種作物造成嚴重產量損失。在巴西，作為全球大豆生產的領導者，南方根結線蟲（M. incognita）和爪哇根結線蟲（M. javanica）是主要的流行種，侵染近65%的大豆田，在受侵染土壤中可導致高達30%的產量損失。此外，其他物種如奇氏根結線蟲（M. paranaensis）、象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）、埃塞俄比亞根結線蟲（M. ethiopica）、花生根結線蟲（M. arenaria）、摩洛哥根結線蟲（M. morocciensis）和盧西根結線蟲（M. luci）在巴西大豆田中也有零星報道，但其分布、影響和共現情況仍知之甚少。
準確的物種鑒定是有效管理策略的基礎。然而，以往針對巴西根結線蟲多樣性的調查范圍有限。早期研究多依賴生化標記（如酯酶譜）或有限的樣本量，往往低估了物種多樣性，且未能檢測到混合種群。自2003年以來，巴西大豆種植模式發生了深刻變化，包括抗性品種的引入、免耕實踐、化學投入品的增加以及短周期品種的雙季種植，這些都可能無意中促進了某些根結線蟲物種的出現或優勢地位。分子技術的發展，特別是基于聚合酶鏈式反應（PCR）的特異性序列擴增區域（SCAR）標記和利用線粒體基因（如細胞色素氧化酶I和II [COI和 COII] 以及NADH脫氫酶亞基5 [NADH5]）的系統發育分析，為精確區分近緣種、鑒定不同生活史階段和檢測隱存種提供了前所未有的精度和可靠性。
本研究旨在通過以下方面彌補上述知識空白：（1）應用整合的生化與分子技術鑒定來自巴西中南部10個關鍵州344個大田樣本的根結線蟲物種；（2）繪制根結線蟲物種的流行率、分布和共現圖譜；（3）調查根結線蟲種群的物種豐富度、相對和絕對豐度；（4）評估線粒體標記（COI, COII和 NADH5）區分巴西根結線蟲物種的潛力。
材料與方法
樣本來源與采集
在2021年1月至2022年3月期間，研究人員訪問了344個種植大豆的田地。從每個田地中，隨機采集了四份土壤和大豆根組織子樣本。每個樣本由大約300克土壤和根系的復合物組成，取自大豆植株根際附近15-20厘米深度的四個點。樣本來源于巴西10個主要大豆生產州：巴伊亞州（BA）、聯邦區（DF）、戈亞斯州（GO）、馬托格羅索州（MT）、南馬托格羅索州（MS）、米納斯吉拉斯州（MG）、圣保羅州（SP）、巴拉那州（PR）、圣卡塔琳娜州（SC）和南里奧格蘭德州（RS）。樣本數量分別為：BA 36個，DF 10個，GO 69個，MT 32個，MS 39個，MG 40個，SP 30個，PR 48個，SC 8個，RS 32個。樣本在冷藏條件下運輸，并在巴西利亞大學生物研究所的溫室內進行處理。
種群飼養與純化
在溫室內，將采集的含大豆根的田間土壤添加到裝有滅菌基質的3升塑料盆中，并移植高感病的番茄（Solanum lycopersicum‘Santa Clara’）和大豆（G. max‘BMX Potência RR’）幼苗，以促進線蟲繁殖。植株在25°C ± 3°C的自然光照條件下培養2個月，以允許根結形成和產卵。此后，檢查植株根系是否有根結。在344個樣本中，有79個（23%）顯示有根結并被確認為根結線蟲陽性。
大田樣本中根結線蟲物種的鑒定
從每個陽性樣本中，提取20只乳白色階段的成年雌蟲，分成四份重復（每份5只個體），并根據Alfenas等人描述的方法，基于酯酶（Est）譜進行物種鑒定。酯酶譜與已知的爪哇根結線蟲J3譜帶進行比較，并結合文獻進行物種鑒定。
此外，還使用物種特異性SCAR-PCR標記進行物種鑒定。SCAR-PCR可以在所有生活史階段檢測線蟲，靈敏度低至10 pg/μL DNA。從所有79個根結線蟲陽性的大田樣本的水性卵懸浮液中提取基因組DNA。使用的引物包括：用于鑒定花生根結線蟲的Far/Rar；用于南方根結線蟲的Finc/Rinc；用于爪哇根結線蟲的Fjav/Rjav；用于奇氏根結線蟲的par-C09-F/par-C09-R；用于象耳豆根結線蟲的MK7F/MK7R；用于埃塞俄比亞根結線蟲的met-F/met-R；以及用于盧西根結線蟲的Mlf/Mlr。
純種群獲取與物種確認
從79個陽性大田樣本中，至少獲得了五個純種群。在每個大田樣本中觀察到的不同酯酶譜指導了DNA提取和線粒體基因的擴增，以確認每個樣本中是否存在多個物種并評估遺傳多樣性。對于通過SCAR-PCR檢測到象耳豆根結線蟲的大田樣本，產生了多達20個純種群以確保分離株的回收。總共成功獲得了75個純種群。
從純種群的DNA中擴增并測序了線粒體基因COI、COII和 NADH5的部分區域。擴增產物用ExoSap-IT純化，并由Macrogen公司進行測序。使用BioEdit手動編輯一致序列，并使用MEGA v.11.0中的MUSCLE進行比對。
系統發育分析與遺傳多樣性
使用MrModelTest v. 2.3基于Akaike信息準則（AIC）為每個基因區域選擇最佳核苷酸替代模型。在MrBayes v. 3.2.3中通過馬爾可夫鏈蒙特卡洛（MCMC）方法進行貝葉斯推斷（BI）系統發育分析。MCMC分析運行10,000,000代，每1000代采樣一次。前2500棵采樣樹被舍棄作為老化部分，后驗概率基于剩余的7500棵樹計算。使用FigTree v. 1.4.3可視化系統發育樹。在分析中使用傷殘根腐線蟲（Pratylenchus vulnus）作為外群。
使用物種豐富度（S）、香農多樣性指數（H′）、辛普森多樣性指數（D）和皮洛均勻度指數（J′）評估了不同巴西州根結線蟲物種的多樣性。使用R包iNEXT（v. 3.0.1）計算S、H′ 和 D指數，隨后使用公式J′ = H′/log(S) 計算J′。此外，使用DnaSP v. 6確定從大豆產區收集的根結線蟲種群中COI、COII和 NADH5區域的單倍型數量。使用矩陣全局比對工具（MatGAT）v. 2.0估算巴西COI、COII和 NADH5序列的成對核苷酸序列同一性分數。
結果
根結線蟲的發生與分布
79個受根結線蟲侵染的樣本來自不同州市，其地理分布如圖所示。物種鑒定結果總結于表格中，顯示了每個樣本的種群編號、州市、酯酶譜、SCAR-PCR結果以及NADH5、COI、COII基因的GenBank登錄號。
物種鑒定與多樣性
生化（酯酶譜）和分子（SCAR-PCR）分析相結合，確認了南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和象耳豆根結線蟲的存在。值得注意的是，SCAR-PCR分析顯示，在44%（35/79）的受侵染田地中存在混合種群，其中兩種或三種根結線蟲物種共存。這是首次在巴西中南部（巴伊亞州、馬托格羅索州、南馬托格羅索州）的商業大豆田中檢測到象耳豆根結線蟲，代表了線蟲管理的一個新興挑戰。
地理分布格局
研究揭示了物種組成和豐度在過去二十年的變化。具體而言：
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南方根結線蟲在馬托格羅索州和戈亞斯州占主導地位。
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爪哇根結線蟲在南部各州（如巴拉那州、圣卡塔琳娜州、南里奧格蘭德州）更為普遍。
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花生根結線蟲的檢測頻率較低。
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象耳豆根結線蟲作為新出現的物種在巴伊亞州、馬托格羅索州和南馬托格羅索州被檢測到。
線粒體標記的鑒別力
對純種群線粒體基因（COI、COII和 NADH5）的系統發育分析驗證了物種鑒定結果。其中，NADH5基因被證明是區分南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲這三個近緣種信息量最豐富的標記，具有更高的分辨率。遺傳多樣性分析進一步揭示了不同物種和地理種群之間的遺傳變異。
結論與意義
這項綜合研究通過大規模采樣和整合先進的生化與分子工具，首次全面描繪了巴西中南部大豆產區根結線蟲的多樣性、分布和共現模式。關鍵發現包括：
- 1.
物種變遷：證實了根結線蟲物種組成在過去二十年發生了變化，南方根結線蟲和爪哇根結線蟲在不同生態區占據優勢。
- 2.
新興威脅：首次在巴西中南部商業大豆田報告了高致病性外來物種象耳豆根結線蟲，這對現有管理策略構成嚴峻挑戰。
- 3.
混合侵染高發：近一半的受侵染田地存在多種線蟲混合發生，這增加了管理復雜性，因為不同物種可能對寄主抗性和化學殺線蟲劑有不同的反應。
- 4.
分子鑒別工具：線粒體基因標記，特別是NADH5，被證實是精確鑒定巴西主要根結線蟲物種的有效工具。
- 5.
管理啟示：研究結果強調了持續監測和基于準確物種鑒定的綜合管理策略的緊迫性。針對單一物種的抗性品種在混合侵染田間可能失效，因此需要開發多抗品種或結合輪作、生物防治等多種手段。
總之，本研究為理解影響巴西大豆生產的根結線蟲物種的動態變化提供了新的重要見解，為制定更有效、可持續的線蟲管理策略奠定了堅實的科學基礎，對于保障全球大豆供應鏈的穩定和糧食安全具有重要意義。
