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基于微CT成像和碘染色技術(shù)的胎兒毒性學(xué)數(shù)字化評(píng)估體系構(gòu)建，通過(guò)三維重建與形態(tài)學(xué)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物胎兒外部形態(tài)、內(nèi)臟及骨骼系統(tǒng)的定量分析，顯著提高評(píng)估效率并降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用。
馬克斯·R·蘭厄姆（Max R. Langham）| 安吉拉·米勒（Angela Miller）| 拉奇娜·帕爾瓦尼（Rachna Parwani）| 基蘭喬特·巴蒂亞（Kiranjot Bhatia）| 伊莉絲·劉易斯（Elise Lewis）| 加納帕蒂·斯里尼瓦薩（Ganapati Srinivasa）| 凱文·馬特洛克（Kevin Matlock）| 馬克·赫特（Mark Hurtt）| 艾倫·霍伯曼（Alan Hoberman）
蒂奧公司（Tio Companies, Inc.），美國(guó)俄勒岡州波特蘭市
摘要
提高化學(xué)和藥品的安全性，同時(shí)減少動(dòng)物使用和研發(fā)成本，是工業(yè)界、監(jiān)管機(jī)構(gòu)和公眾的共同目標(biāo)。我們描述了一種數(shù)字成像技術(shù)，旨在替代威爾遜和斯泰普爾斯（Wilson and Staples）提出的方法，該方法通過(guò)對(duì)外部、內(nèi)臟和骨骼的成像來(lái)觀(guān)察大鼠胎兒。從定時(shí)配對(duì)的Crl:CD[SD]大鼠中選取妊娠第21天的胎兒，對(duì)其進(jìn)行安樂(lè)死處理，用含碘的造影劑染色，嵌入瓊脂糖中，然后使用ZEISS Xradia Versa微型CT系統(tǒng)進(jìn)行掃描。利用Slicer和Dragonfly 3D World軟件重建并分割顱骨和大腦的三維圖像。由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的胎兒形態(tài)學(xué)家對(duì)關(guān)鍵解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行審核，以確認(rèn)其準(zhǔn)確性。將樣本浸泡在5%盧戈?duì)柸芤海↙ugol’s solution）中72至96小時(shí)后，軟組織對(duì)比度變得均勻。由此產(chǎn)生的三維μCT數(shù)據(jù)集能夠?qū)崿F(xiàn)高質(zhì)量的外部和內(nèi)臟評(píng)估，其效果與傳統(tǒng)方法相當(dāng)。未經(jīng)染色的樣本的骨骼評(píng)估具有診斷價(jià)值，而經(jīng)過(guò)染色的樣本的分割骨骼特征則不具備這種價(jià)值。總體而言，結(jié)合可解釋性人工智能框架的CT成像技術(shù)有望通過(guò)定量、可重復(fù)的評(píng)估來(lái)簡(jiǎn)化發(fā)育毒理學(xué)研究，同時(shí)減少勞動(dòng)強(qiáng)度和主觀(guān)性。監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可、GLP合規(guī)性以及有吸引力的行業(yè)價(jià)值主張對(duì)于該技術(shù)的廣泛應(yīng)用至關(guān)重要。
部分內(nèi)容摘錄
背景
發(fā)育毒理學(xué)研究旨在識(shí)別那些在孕婦懷孕前或妊娠關(guān)鍵階段接觸后可能對(duì)發(fā)育中的后代造成風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)。1966年制定了評(píng)估發(fā)育中的后代間接接觸潛在毒物的標(biāo)準(zhǔn)[1]，這些標(biāo)準(zhǔn)在20世紀(jì)90年代得到了進(jìn)一步完善[2]、[3]、[4]，并在2020年進(jìn)行了優(yōu)化[5]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常為嚙齒類(lèi)動(dòng)物（如大鼠）。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
實(shí)驗(yàn)對(duì)象為妊娠第21天的胎兒，這些胎兒來(lái)自未經(jīng)處理的定時(shí)配對(duì)的Crl:CD[SD]雌性大鼠，這些大鼠飼養(yǎng)在美國(guó)賓夕法尼亞州霍舍姆市的查爾斯河實(shí)驗(yàn)室（Charles River Laboratories, Inc.）。通過(guò)剖宮產(chǎn)手術(shù)從母體中取出胎兒，然后通過(guò)腹腔注射戊巴比妥（pentobarbital）對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到了機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。樣本采集過(guò)程遵循了經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法和標(biāo)準(zhǔn)。
染色方法
無(wú)論是0.1 N的碘化鉀（potassium iodide）還是5%的盧戈?duì)柸芤海↙ugol’s solution），都能使組織得到良好染色，從而清晰顯示解剖結(jié)構(gòu)。但在樣本1和樣本2中，將組織浸泡在碘溶液中48小時(shí)后，即使進(jìn)行了腹部切口處理，部分胸部和腹部仍未能充分染色，導(dǎo)致掃描時(shí)出現(xiàn)空洞（見(jiàn)圖4）。使用緩沖后的盧戈?duì)柸芤嚎梢栽诟鱾�(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)現(xiàn)更均勻的染色效果，即使經(jīng)過(guò)96小時(shí)的染色也不會(huì)過(guò)度染色。然而，某些小區(qū)域的染色效果仍然不佳。
討論
目前用于發(fā)育毒理學(xué)測(cè)試的方法已經(jīng)發(fā)展了60多年，并且行之有效。數(shù)字化是一種逐步提高發(fā)育毒理學(xué)測(cè)試效率和準(zhǔn)確性的方法，它通過(guò)使用μCT掃描替代傳統(tǒng)的解剖顯微鏡檢查來(lái)實(shí)現(xiàn)。這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究表明，可以對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行外部、內(nèi)臟和骨骼的成像，甚至可能通過(guò)單次掃描完成所有檢查。此外，
作者貢獻(xiàn)聲明
基蘭喬特·巴蒂亞（Kiranjot Bhatia）：撰寫(xiě)、審稿與編輯、數(shù)據(jù)可視化、軟件開(kāi)發(fā)、方法論設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。拉奇娜·帕爾瓦尼（Rachna Parwani）：撰寫(xiě)、審稿與編輯、資源管理、方法論設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)整理。安吉拉·米勒（Angela Miller）：撰寫(xiě)、審稿與編輯、方法論設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)整理。小馬克斯·蘭厄姆（Max R. Langham Jr.）：撰寫(xiě)、審稿與編輯、初稿撰寫(xiě)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、項(xiàng)目監(jiān)督、軟件開(kāi)發(fā)、資源管理、方法論設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析。
利益沖突聲明
作者聲明以下可能構(gòu)成利益沖突的財(cái)務(wù)關(guān)系/個(gè)人關(guān)聯(lián)：馬克斯·蘭厄姆（Max Langham）從蒂奧公司（Tio Companies, Inc.）獲得了資助；他與該公司存在董事會(huì)成員身份及股權(quán)或股票持有關(guān)系。加納帕蒂·斯里尼瓦薩（Ganapati Srinivasa）與蒂奧公司存在董事會(huì)成員身份及股權(quán)或股票持有關(guān)系。凱文·馬特洛克（Kevin Matlock）也與蒂奧公司存在類(lèi)似關(guān)系。
致謝
我們感謝德雷塞爾大學(xué)材料表征核心實(shí)驗(yàn)室（Drexel University Materials Characterization Core）提供的Xradia 630系統(tǒng)，該實(shí)驗(yàn)室位于賓夕法尼亞州費(fèi)城市場(chǎng)街3126號(hào)（3126 Market Street, Philadelphia, PA 19104）。
