《Scientific Reports》：Comparative evaluation and validation of rapid quantification methods for Mycoplasma hyopneumoniae: development of a PMA-based viability qPCR assay
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本文針對豬肺炎支原體體外生長緩慢、傳統定量方法耗時長達四周的難題，研究人員比較了CCU、CFU、流式細胞術和ATP發光法等多種方法，并成功建立并優化了基于PMA的活菌定量PCR (v-qPCR)檢測技術。該研究首次為支原體屬提供了經過驗證的v-qPCR方法，可將檢測時間縮短至數小時，為豬肺炎支原體凈化計劃提供了潛在的有力工具。
在養豬業中，一種被稱為豬地方流行性肺炎的疾病持續造成重大的經濟損失，其背后的“元兇”是一種名為豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae, M. hyopneumoniae) 的微小病原體。這種病原體有個令人頭疼的特性：它在實驗室里生長得極其緩慢，就像一個行動遲緩的“慢性子”。為了研究它、控制它，科學家們需要知道它在培養液里到底有多少“活著的”個體，這就涉及到“定量”技術。然而，傳統的“金標準”方法，比如顏色變化單位 (CCU) 和菌落形成單位 (CFU)，需要培養長達四周的時間才能得到結果，這無疑大大拖慢了研究和診斷的步伐。有沒有更快、更準的方法來清點這些“活著的”細菌呢？這正是本研究試圖破解的核心難題。
盡管文獻中記載了包括流式細胞術、ATP發光法以及使用疊氮溴化乙錠 (EMA) 或單疊氮化丙啶 (PMA) 的活菌定量聚合酶鏈式反應 (viability quantitative polymerase chain reaction, v-qPCR) 等多種潛在的快速方法，但這些方法之間的一致性如何？哪種方法最適合用于豬肺炎支原體？此前并沒有系統的比較和驗證。因此，研究人員開展了一項系統的研究，旨在評估和比較不同的豬肺炎支原體定量方法，驗證一種準確的實時定量途徑，并為這種具有挑戰性的病原體量身定制一種v-qPCR檢測方法。這項研究的意義在于，有望將檢測時間從“月”縮短到“小時”，為更高效的疾病監測和凈化提供關鍵技術。相關成果發表在《Scientific Reports》上。
為開展本研究，研究人員主要運用了以下關鍵技術方法：使用了三株豬肺炎支原體 (232, J, 和 2010) 進行體外生長動力學評估；系統比較了顏色變化單位 (CCU)、菌落形成單位 (CFU)、流式細胞術和ATP發光法四種定量方法；建立了一套激光共聚焦掃描顯微鏡 (confocal laser scanning microscopy, CLSM) 方案，用于直接定量培養基中的細菌，并以此驗證流式細胞術的準確性；開發并優化了一種基于單疊氮化丙啶 (PMA) 的活菌定量PCR (v-qPCR) 檢測方法。
研究結果
不同定量方法對豬肺炎支原體生長動力學的比較評估
本研究首先對三株豬肺炎支原體 (232, J, 和 2010) 的體外生長動力學進行了評估，使用了CCU、CFU、流式細胞術和ATP發光法四種方法。結果顯示，盡管不同方法測得的絕對數量存在差異，但所有方法都描繪出了相似的生長動態曲線，并且各檢測方法之間表現出高度相關性。這表明，流式細胞術和ATP發光法等快速方法能夠可靠地反映豬肺炎支原體的生長情況，可以作為傳統耗時方法的有效替代。
通過CLSM和流式細胞術對豬肺炎支原體進行絕對定量
為了更準確地驗證流式細胞術的計數結果，研究人員建立了一套CLSM方案，能夠直接在培養基中對細菌進行成像和計數。在可控條件下，使用CLSM的計數結果來驗證流式細胞術的準確性。分析表明，對于菌株232，兩種方法的結果呈現極強的相關性 (r = 0.9973)；對于菌株J，相關性為中等 (r = 0.8933)。這一部分工作為流式細胞術定量豬肺炎支原體活菌提供了重要的顯微鏡學驗證。
開發用于豬肺炎支原體活菌檢測的v-qPCR方法
研究的核心成果是開發了一種基于PMA的v-qPCR檢測方法。PMA是一種染料，只能穿透死菌的細胞膜并與DNA結合，在光照下使DNA失活，從而在后續的qPCR (quantitative polymerase chain reaction) 中只擴增活菌的DNA。研究人員對該方法進行了優化。結果顯示，v-qPCR檢測到的活菌數量與流式細胞術檢測到的活細胞數量呈強相關 (菌株232的R2值為0.9726；菌株J為0.8628；菌株2010為0.9933，p < 0.05)。對于參考菌株232，該v-qPCR方法的檢測限為5 × 104個活菌細胞/毫升。這標志著首次為支原體屬建立了一種經過驗證的PMA-v-qPCR檢測方法。
結論與意義
本研究通過系統的比較和驗證，得出以下核心結論：首先，流式細胞術、ATP發光法等快速定量方法與傳統的CCU、CFU方法在反映豬肺炎支原體生長動力學上具有良好的一致性，可以替代耗時漫長的傳統方法。其次，建立的CLSM方案為流式細胞術的準確性提供了直接證據。最重要的是，本研究成功開發并優化了一種針對豬肺炎支原體的、基于PMA的v-qPCR檢測方法。該方法與流式細胞術結果高度相關，并具有高靈敏度。
這項研究的意義重大。它首次為支原體這一大類的病原體提供了經過驗證的PMA-v-qPCR檢測方案。所建立的流式細胞術和CLSM方案也能用于快速、準確地區分豬肺炎支原體的活菌與死菌。這些方法將定量檢測所需的時間從CCU或CFU所需的四周 dramatically 縮短到了僅僅幾個小時。這不僅極大提升了實驗室研究的效率，更重要的是，一旦在臨床樣本中得到進一步驗證，這種v-qPCR方法有望成為豬肺炎支原體凈化計劃中一個極具價值的工具，為實現快速診斷、監測和評估凈化效果提供關鍵技術支撐，最終助力于減少養豬業因該病原導致的經濟損失。
