全球抗菌藥物耐藥性（AMR）對公共衛生構成了日益嚴重的威脅[1]，[2]，[3]，[4]，其耐藥機制的發展速度超過了新藥物的研發速度[5]。優化現有療法對于限制多重耐藥（MDR）病原體的傳播至關重要[6]，[7]。這需要精確選擇、劑量控制和抗生素的使用時間，因此抗菌藥物敏感性測試（AST）對于指導針對性治療和防止廣譜抗生素的濫用至關重要[8]，[9]。因此，開發快速可靠的AST方法對于改善臨床結果、減緩AMR的進展和支持有效的抗菌藥物管理至關重要。
傳統的AST方法，如紙片擴散法、E-test和肉湯稀釋法（BMD），被視為臨床金標準[10]，[11]。這些方法通過測量多樣且異質的細菌群體的整體行為來確定最小抑制濃度（MIC），即防止可見生長的最低抗菌藥物濃度[12]。MIC值是分析表型耐藥性的關鍵參數，有助于評估新抗生素的有效性，并為治療指南提供依據[13]。然而，這些基于群體的方法需要較長的培養時間，通常從樣本采集到最終結果需要數小時甚至數天。這種漫長的時間線是一個主要缺點，因為需要分離和培養細菌，然后通過多次細胞分裂周期后觀察渾濁度或測量吸光度。在此關鍵期間，臨床醫生常常憑經驗開具廣譜抗生素，以防止患者病情惡化[14]，無意中促進了更廣泛的AMR的出現。
除了速度問題外，傳統方法還存在測量不準確的問題。它們容易產生假陽性結果，因為它們假設細菌培養的渾濁度與其細胞數量之間存在線性關系，但這一前提往往不成立，因為某些抗生素可以改變細菌的形態和大小[15]，[16]，[17]。此外，它們無法考慮細菌群體內的固有異質性，可能導致假陰性結果[18]。通過測量整個群體的行為，它們可能無法檢測到罕見的耐藥亞群，從而提供有限的早期表型反應信息。這可能導致藥物效力的錯誤分類，導致使用無效藥物或排除潛在有用的藥物。因此，最近的AST進展集中在通過監測較小細菌亞群的增殖來減少檢測時間，從而使臨床醫生能夠更快、更明智地做出治療決策。
基于微流控的AST方法因其能夠在受控微環境中進行高通量檢測而成為強大的替代方案[19]，[20]。液滴微流控技術能夠將單個細菌細胞隔離在液滴中，從而在幾小時內識別出具有耐藥表型的罕見細菌及其異質性[21]，[22]，[23]，[24]，[25]，[26]，[27]。單個細菌的隔離允許高度敏感地監測表型的細微變化，包括代謝、基因組成、形態或復制的改變。利用這種方法，多項研究表明可以在不到12小時內獲得MIC值，顯著快于傳統的表型AST方法。
此外，基于光學成像的方法通過監測細菌增殖和在不同抗生素條件下的單細胞生長動態來加速AST[24]，[28]。然而，這些技術通常依賴于將細菌固定在結構化環境中，如瓊脂糖凝膠基質、介電泳陷阱、受限微通道和納升級孔[29]，[30]，[31]，[32]。它們通常需要復雜的高分辨率光學設置和多個視野的連續監測，從而增加了系統的復雜性和成本，并限制了其臨床應用性。另一種方法是通過懸臂式質量測量、異步磁珠旋轉和增強氧氣輸送的方法來檢測微妙的物理或代謝變化[33]，[34]，[35]，[36]。盡管如此，這些方法往往涉及復雜的讀數，并且尚未在多個抗生素濃度下實現可擴展或多路復用。
單細胞水平分析也越來越受到關注，因為它能夠解析表型異質性并揭示在群體平均結果中常被掩蓋的具有不同抗生素反應的亞群[26]，[37]，[38]，[39]。盡管已經展示了多種不同的方法，包括基于光學、熒光和阻抗的細胞反應檢測方法，但仍存在一個關鍵缺口，因為它們仍然依賴于細胞增殖，這延遲了最終的分類。這突顯了需要一種新的方法，能夠捕捉到對抗生素壓力的快速細胞反應，例如代謝活動，而不僅僅依賴于可見生長。
已知殺菌性抗生素會通過干擾細胞穩態和代謝途徑來觸發活性氧（ROS）的產生[40]，[41]。量化ROS可以檢測到細胞數量可測量變化之前的早期氧化應激反應，提供了更快且可能更具信息量的抗生素效力指標[42]，[43]，[44]，[45]。與基于渾濁度的生長測量、阻抗傳感或依賴群體擴張的代謝染料等替代AST方法相比，ROS敏感熒光能夠在幾十分鐘內檢測到抗生素誘導的細胞應激。由于ROS生成代表了細胞分裂之前的早期代謝反應，因此可以在不需要等待可測量生物量增加的情況下評估敏感性，這是傳統基于生長的檢測方法中的根本時間限制步驟。然而，由于在單細胞水平上將ROS動態與表型敏感性相關聯的技術挑戰，基于ROS的AST尚未得到廣泛應用。此外，難以將ROS水平與細胞密度等混淆因素分離，也阻礙了建立穩健的分類閾值。
在這項研究中，我們提出了一種基于ROS的微流控平臺，該平臺將濃度梯度的形成與隨后將單個細菌、抗生素和ROS敏感染料封裝在液滴中結合起來，以實現快速AST。我們的方法同時量化了單細胞水平上的ROS信號和細菌細胞數量，允許將每個細胞的ROS變化倍數標準化作為敏感性指標。這種方法不僅將檢測時間縮短至90分鐘內，還揭示了批量測量中隱藏的表型異質性。
我們使用20種不同的臨床分離株驗證了該平臺的穩健性和臨床相關性，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、多重耐藥金黃色葡萄球菌（MDRSA）以及耐多粘菌素和大腸桿菌。我們的結果直接與使用金標準BMD方法獲得的結果進行了比較。重要的是，基于ROS的AST使我們能夠識別出表現出部分耐藥性或耐受性的亞群。該平臺不僅提供了快速準確的AST，還提供了關于抗生素作用和耐藥機制的基本見解，在時間效率和分析分辨率方面相比傳統的依賴生長的方法具有顯著優勢。能夠在臨床重要病原體上進行快速AST測試，有潛力加快臨床結果的速度，最終有助于更快地為患者開具適當的抗生素。
