《Veterinary Microbiology》：Genome-Wide Comparison Analysis of
Brucella Attenuated Vaccine Strain BA0711 and
Brucella Wild-Type Strain M28 and Establishment of a Dual qPCR Differentiation Method
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布魯氏菌疫苗株BA0711的基因組比較及qPCR檢測方法開發。通過全基因組測序和功能分析，發現BA0711與野生株M28相比在染色體I和II存在199和144個基因變異，導致能量代謝、應激防御等關鍵功能減弱，但保留宿主適應性和免疫原性。建立的雙TaqMan qPCR方法可靈敏檢測（1×101拷貝/μL）并區分疫苗株、野生株及混合感染，為布魯氏病防控提供精準診斷工具。
謝明明|孫一鳴|高娃|劉曉芳|盧靜|王文龍|劉春霞
內蒙古農業大學獸醫學院，農業農村部動物疾病臨床診斷與治療技術重點實驗室，中國內蒙古自治區呼和浩特市，010010
摘要
布魯氏菌病是一種由布魯氏菌屬（Brucella）引起的動物源性疾病，對畜牧業生產和公共衛生構成嚴重威脅。疫苗免疫仍然是預防和控制該疾病的關鍵策略。本研究旨在闡明布魯氏菌減毒疫苗株BA0711的毒力減弱機制的遺傳基礎。我們完成了布魯氏菌減毒疫苗株BA0711的全基因組測序和功能注釋，并與野生型布魯氏菌株M28進行了系統的基因組比較。結果表明，與野生型布魯氏菌株M28相比，布魯氏菌減毒疫苗株BA0711 I和II在1號和2號染色體上分別具有199個和144個突變、缺失以及獨特的基因片段。盡管布魯氏菌減毒疫苗株BA0711保持了較強的宿主適應性和活力以及免疫原性，但其基因組缺乏編碼冷休克蛋白和谷氨酰胺轉移酶的基因。功能注釋顯示，與野生型布魯氏菌株M28相比，其在能量代謝、應激防御、耐藥性、毒力表達和基因組可塑性方面存在缺陷。基于全基因組測序數據，我們開發了一種差異化的TaqMan qPCR檢測方法。該方法通過針對布魯氏菌減毒疫苗株BA0711的特定基因片段，表現出高靈敏度（1×101拷貝/μL）、優異的特異性以及高穩定性（批內和批間變異系數低于0.5%）。對100個樣本的檢測證明了該方法能夠準確區分布魯氏菌減毒疫苗株BA0711、其他布魯氏菌血清型以及混合感染。本研究為流行病學監測、預防策略制定以及臨床診斷和治療提供了可靠的參考，有助于減輕布魯氏菌病對公共衛生和畜牧業的潛在威脅。
引言
布魯氏菌病是一種由布魯氏菌屬（Brucella）引起的動物源性疾病（De Figueiredo等人，2015年）。該疾病在全球范圍內廣泛傳播，影響了170多個國家和地區（Fusco等人，2024年，Fusco等人，2024b年），可能導致重大經濟損失，對全球畜牧業和公共衛生構成嚴重威脅。世界動物衛生組織將其列為B類動物疾病，中國將其列為II類動物疾病。經典的布魯氏菌屬包括六個血清型（Al Dahouk等人，2017年），如布魯氏菌梅利滕西斯（Brucella melitensis）、布魯氏菌流產（Brucella abortus）和布魯氏菌豬（Brucella suis）。其中，布魯氏菌梅利滕西斯對人類的威脅最大，其次是布魯氏菌豬，而布魯氏菌流產的毒力相對較弱（Xiong等人，2021年）。巨噬細胞、樹突狀細胞和滋養層細胞是布魯氏菌感染初期的主要靶標（Deng等人，2019年）。細菌進入宿主細胞后，會被宿主膜包裹形成含有布魯氏菌的液泡（BCV）（Archambaud等人，2010年；Celli，2015年；Kohler等人，2002年）。BCV首先獲得早期內體特征（eBCV），然后轉變為具有相應分子標記的晚期內體（Guimar?es等人，2025a年；Guimar?es等人，2025b年）。同時，液泡與溶酶體的融合會導致液泡酸化并殺死大多數細菌，這一過程對于IV型分泌系統（T4SS）的VirB成分的表達至關重要，而VirB是布魯氏菌的關鍵毒力因子（Roux等人，2007年；Starr等人，2008年）。經過這種受控融合后，BCV依次分化為復制型BCV（rBCV）（Guimar?es等人，2025a年；Guimar?es等人，2025b年），并進一步成熟為自噬型BCV（aBCV）（Starr等人，2012年）。除了T4SS之外，其他毒力決定因子如脂多糖（LPS）（Barquero-Calvo等人，2007年；Masjedian Jezi等人，2019年）和BvrR/BvrS雙組分系統（G?owacka等人，2018年；Coloma-Rivero等人，2022年）也共同促進了細菌對宿主細胞表面的識別和附著，從而建立了有利于細菌生存的細胞內環境。
深入研究布魯氏菌的致病機制是建立布魯氏菌病預防和控制體系的關鍵組成部分，而開發精確、簡單且高度特異的診斷方法是預防和控制工作的另一個關鍵要素。分子生物學檢測技術具有操作簡便、高準確性和強適應性的特點。實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）是分子生物學檢測技術中的關鍵方法（Shahrajabian，Sun，2024年）。通過使用熒光標記探針或雙鏈結合染料，它可以實時監測核酸擴增過程，并實現對目標序列的精確定量（Quan等人，2018年）。這顯著提高了檢測靈敏度和特異性，同時基于基因組變異位點促進了不同物種之間的鑒別診斷。目前，中國控制布魯氏菌病的方法結合了疫苗接種、檢疫和消滅措施。常用的疫苗包括布魯氏菌減毒疫苗株S2、布魯氏菌減毒疫苗株A19、布魯氏菌減毒疫苗株Rev.1（Hou等人，2019年）和布魯氏菌減毒疫苗株BA0711。然而，一些接種疫苗的動物可能會出現類似自然感染的癥狀，表明布魯氏菌疫苗可能會干擾疾病診斷。傳統的檢測方法無法區分布魯氏菌減毒疫苗株BA0711感染與其他布魯氏菌血清型的感染。因此，開發一種能夠區分布魯氏菌疫苗株BA0711感染與其他布魯氏菌血清型感染的檢測方法至關重要。本研究通過全基因組測序和比較功能分析，闡明了布魯氏菌疫苗株BA0711的基因組功能和毒力減弱機制的遺傳基礎。此外，基于該疫苗株中的特定基因缺失片段，建立了一種能夠準確區分布魯氏菌減毒疫苗株BA0711、野生型布魯氏菌株及其混合感染的qPCR檢測方法。這種方法旨在為布魯氏菌病的精確診斷提供參考。
樣本來源
樣本來源
布魯氏菌減毒疫苗株（BA0711、Rev.1、A19、S2和M5-90Δ26）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巴氏桿菌（Pasteurella）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）和假結核分枝桿菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）的基因組DNA樣本保存在中國內蒙古農業大學預防獸醫學實驗室。
從內蒙古自治區呼和浩特市的一個羊場收集了100個樣本（包括抗凝和非抗凝樣本）
布魯氏菌減毒疫苗BA0711的全基因組測序結果和功能基因分析
布魯氏菌減毒疫苗株BA0711的全基因組長度為3,310,438 bp（約3.31 Mb）。1號染色體長度為2,125,891 bp，2號染色體長度為1,184,547 bp（圖1）。測序深度為656×，總GC含量為57.22%。編碼區總長度為2,881,897 bp，包含3,148個蛋白質編碼基因，平均基因長度為896 bp。基因組中含有55個tRNA基因、9個rRNA基因（5S、16S和23S各3個）以及1個tmRNA基因，沒有sRNA基因。
討論
與野生型布魯氏菌株M28相比，布魯氏菌減毒疫苗株BA0711在1號染色體上缺乏一個冷休克蛋白基因片段。CspA家族在大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中已被充分研究（Ermolenko和Makhatadze，2002年；Phadtare和Inouye，2004年；Phadtare，2004年），并已被證明在布魯氏菌的代謝調節和毒力中起關鍵作用（Wang等人，2015年）。這種蛋白質的缺失降低了疫苗株應對壓力的能力。
結論
從功能遺傳學角度來看，布魯氏菌減毒疫苗株BA0711保留了關鍵的免疫原性、跨物種保護潛力以及多重耐藥機制，同時通過精確調控毒力相關基因實現了毒力減弱。與野生型株M28相比，其致病性顯著降低，是一種高效且安全的布魯氏菌病控制候選疫苗。
本研究成功建立了一種特定的檢測方法
未引用的參考文獻
（Wang等人，2016年；Wang等人，2014年；Kim等人，2016年）
資助
本研究得到了以下資助：內蒙古自然科學基金（項目編號2025LHMS03024）、內蒙古自然科學基金（項目編號2025MS03010）、內蒙古一流學科研究專項（獎項編號YLXKZX-NND-012）
作者貢獻聲明
謝明明和孫一鳴負責起草手稿，對布魯氏菌減毒疫苗株BA0711和毒力株M28進行了組學分析，并開發了差異化的雙TaqMan qPCR檢測方法。樣本收集和檢測工作由高娃、盧靜和劉曉芳完成。研究設計由王文龍教授和劉春霞教授負責，他們還領導了基因組數據分析工作。
作者貢獻聲明
謝明明：寫作——審稿與編輯、初稿撰寫、可視化、驗證、方法學、研究設計。
高娃：驗證、監督、概念構建。
孫一鳴：寫作——初稿撰寫、可視化、監督、概念構建。
劉春霞：寫作——審稿與編輯、驗證、監督、方法學、數據管理、概念構建。
王文龍：寫作——審稿與編輯、驗證、監督、資源協調、方法學。
盧靜：可視化、驗證。
致謝
感謝王文龍教授和劉春霞教授在本研究中的關鍵指導和支持。同時，我們也感謝內蒙古呼和浩特市的一個羊場提供了臨床血液樣本。此外，我們感謝本研究中使用的公共數據庫提供的寶貴資源。
利益沖突聲明
本文的所有作者聲明他們與可能不恰當地影響研究結果的其他個人或組織沒有財務或個人關系。
