《Virology》：Exploring the possible cause of different levels of RNA silencing against BNYVV in transgenic sugar beets: a comparative virus transcriptome study
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RNA干擾誘導的抗甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）轉基因甜菜存在田間抗性差異，通過RNA-seq和小RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，共侵染的甜菜土壤傳帶病毒（BSBV）和甜菜衛(wèi)星病毒（BSV）導致RNA沉默系統(tǒng)減弱，從而影響B(tài)NYVV抑制效果。
穆罕默德·阿明·巴格里（Mohammad Amin Baghery）| 馬赫迪耶·優(yōu)塞菲阿拉（Mahdieh Yousefiara）| 穆罕默德·阿里·馬爾布比（Mohammad Ali Malboobi）| 瑪麗亞姆·科什納米（Maryam Khoshnami）| 法伊茲·法拉基（Faezeh Falaki）| 阿卜杜勒雷扎·巴赫里（Abdolreza Bagheri）| 納斯林·莫斯塔吉（Nasrin Moshtaghi）
伊朗德黑蘭國家遺傳工程與生物技術研究所農業(yè)生物技術研究所
摘要 甜菜因其高蔗糖含量而成為最重要的經濟作物之一。然而，全球甜菜生產受到甜菜壞死黃脈病毒 （BNYVV）的嚴重威脅。開發(fā)抗性轉基因品種是控制這種疾病的一種有前景的方法。我們的團隊通過引入攜帶BNYVV正義鏈和反義鏈5’-UTR序列的構建體（分別包含或不包含外殼蛋白（CP21）編碼序列），成功地在兩個轉基因品系S3和S6中產生了對BNYVV的RNA沉默誘導抗性。然而，在某些轉基因植物后代中，基于RNA沉默的抗性可能會減弱或失效。本研究利用高通量病毒轉錄組分析來探討具有相同遺傳背景的轉基因甜菜之間BNYVV傳播水平差異的可能原因。RNA-seq和small RNA-seq結果顯示不同樣本間的病毒傳播水平存在差異。定量RT-PCR和莖環(huán)PCR表明RNA沉默機制能夠有效地將轉基因轉錄本轉化為siRNAs。隨后證實所有具有感染性的BNYVV都屬于A型生態(tài)型，其與S3和S6轉基因的序列同源性分別為96.3%和98.3%。有趣的是，在高度感染的樣本中檢測到了甜菜土傳病毒 （BSBV）、甜菜隱秘病毒2 （BCV2）和甜菜衛(wèi)星病毒 （BSV）。詳細分析表明，轉基因植物中BSBV和BSV的同時存在可能與BNYVV的RNA沉默作用減弱有關。
引言 甜菜是一種非常重要的工業(yè)作物，因為它含有高濃度的蔗糖，可滿足全球約30%的糖需求（Dohm等人，2014年）。多種傳染性病毒對甜菜的產量和質量具有毀滅性影響。其中之一就是甜菜壞死黃脈病毒 （BNYVV），它是導致根腫病的病原體，可使甜菜產量損失高達80%（Biancardi和Lewellen，2016年）。BNYVV由Polymyxa betae 傳播，這是一種土壤傳播的原生動物，它是許多植物（包括甜菜）的專性根部寄生蟲，可以通過產生休眠孢子在土壤中長期存活（Biancardi和Lewellen，2016年；Pferdmenges，2007年）。這使得在田間控制這種疾病極具挑戰(zhàn)性。迄今為止，控制根腫病的唯一有效方法是使用攜帶< />和< />抗性基因的品種（De Biaggi等人，2010年）。然而，通過傳統(tǒng)育種方法開發(fā)的品種對抗新株系的BNYVV的抗性經常會被破壞（Kutluk Yilmaz等人，2018年；Liebe等人，2023年；Nakagami等人，2022年）。
通過基因工程引入新的抗性來源可能是解決這一問題的方法（Dhir等人，2019年；Palukaitis，2011年）。在過去十年中，已經開發(fā)了幾種基于病原體誘導抗性（PDR）的策略來培育抗性植物（Palukaitis，2011年；Uslu和Wassenegger，2020年）。利用RNA沉默作為植物的天然防御機制來誘導抗病毒抗性是一種眾所周知的方法（Lu等人，2003年；Uslu和Wassenegger，2020年）。這種方法涉及將特定的病毒序列整合到植物基因組中，從而通過產生短干擾RNA（siRNAs）來觸發(fā)針對目標病毒的RNA沉默（Duan等人，2012年；Lu等人，2003年）。盡管如此，轉基因介導的抗性可能受到多種因素的影響，導致抗性水平不一，從完全恢復到弱抗性不等（Duan等人，2012年；Prins等人，2008年）。植物中這種現(xiàn)象的機制尚不完全清楚。據(jù)認為，高效抗性的第一步是轉基因的高表達，這會觸發(fā)RNA沉默機制。否則，轉基因衍生的siRNAs積累不足會導致抗性延遲或無效（Duan等人，2012年；Prins等人，2008年）。病毒的致病類型也會影響宿主的抗性和感染程度（Liebe等人，2023年）。多項研究表明，某些類型的BNYVV可能導致甜菜抗性減弱（Liebe等人，2023年；Nakagami等人，2022年；Peltier等人，2008年）。此外，病毒衍生的轉基因與目標病毒之間的序列同源性也是一個重要因素。當感染病毒的序列與轉基因序列相差超過10%時，抗性機制可能會減弱（Duan等人，2012年）。此外，植物在田間可能同時暴露于多種異源病毒（Moreno和López-Moya，2020年）。特別是，已經發(fā)現(xiàn)一種異源病毒可能通過RNA沉默抑制機制增強另一種病毒的感染（Anand等人，2022年；Aulia等人，2019年）。其中，多種甜菜病毒由Polymyxa betae 傳播，包括甜菜土傳病毒 （BSBV）、甜菜土傳花葉病毒 （BSBMV）、甜菜橡葉病毒 （BOLV）和甜菜病毒Q （BVQ），這些病毒可能與BNYVV有協(xié)同或拮抗作用（Bornemann和Varrelmann，2011年）。
準確檢測和鑒定感染轉基因植物的病毒組成及其遺傳特征有助于理解沉默水平差異的原因（Jeevalatha等人，2023年；Ko等人，2018年；Li等人，2016年）。下一代測序（NGS）技術的發(fā)展以及數(shù)據(jù)處理平臺的巨大進步為快速、準確、經濟高效的大規(guī)模病毒群體測序奠定了基礎（Lecuit和Eloit，2015年；Villamor等人，2019年；Weiland等人，2020年）。大多數(shù)植物病毒具有RNA基因組，即使那些具有DNA基因組的病毒也會表達RNA轉錄本。在這種情況下，RNA-Seq技術是一個強大而有效的工具，因為它可以提供樣本中所有RNA病毒的概覽（Jones等人，2017年；Weiland等人，2020年）。此外，小RNA測序（sRNA-Seq）最近也成為一種流行的工具，可以提供關于植物中病毒衍生siRNAs的寶貴信息（Guo等人，2015年；Li等人，2016年；Sun等人，2020年）。
我們的團隊成功培育出了對根腫病具有RNA沉默誘導抗性的轉基因植物，通過誘導針對BNYVV外殼蛋白的基因沉默（Safar等人，2021年；Zare等人，2015年）。然而，在某些后代中觀察到不同程度的病毒傳播，尤其是在田間評估中。因此，盡管基因相同，植物對病毒傳播的抑制程度卻有所不同。為了解決這個問題，本研究旨在使用NGS方法（RNA-Seq和sRNA-Seq）對受BNYVV感染的轉基因植物根部的病毒RNA譜進行比較分析。
部分內容 植物和生長條件 使用了先前開發(fā)的轉基因甜菜品系219-T3: S3-13.2（S3）和6018-T3: S6-44（S6），這些品系攜帶帶有或不帶有BNYVV外殼蛋白（CP21）編碼序列的正義鏈和反義鏈5’UTR序列，并置于35S-CaMV啟動子下（補充圖S1）（Zare等人，2015年）。本研究中使用的對照野生型親本植物為9597（WT），由伊朗卡拉杰的甜菜種子研究所提供。每株植物的種子被播種在光照周期為16/8小時的植物生長箱中RNA-seq分析 對第三代轉基因甜菜品系S3和S6的根部分別攜帶pIHP-P和pIHP-U構建體的根樣本進行了RNA測序（Zare等人，2015年），同時對其野生型親本9597也進行了測序，每個樣本進行了兩次生物學重復實驗�？偣采闪思s20 GB的數(shù)據(jù)，包含大約1.36億個讀段（每個讀段150 bp），所有庫的序列質量至少達到97%（質量分數(shù)超過Q20；表1）。討論 盡管RNA沉默介導的抗性已被證明可以有效保護植物免受病毒侵害，但由于其在不同條件下的抗性水平變化，這種方法仍存在一些問題。本研究旨在通過比較轉錄組分析來探討轉基因植物中BNYVV感染程度差異的原因。幾乎所有轉基因品系都表現(xiàn)出足夠的抗性
結論 本研究旨在探討RNA沉默誘導的轉基因甜菜中BNYVV抗性水平差異的可能原因。經過分析多種可能的原因，我們發(fā)現(xiàn)那些BNYVV積累量較高的轉基因植物同時感染了BSBV和BSV。所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明BSV、BSBV和BNYVV RNA的積累之間存在關聯(lián)，并且這導致了轉基因植物中RNA沉默系統(tǒng)的減弱（圖6）。
CRediT作者貢獻聲明 阿卜杜勒雷扎·巴赫里（Abdolreza Bagheri）： 撰寫 – 審稿與編輯，監(jiān)督，概念設計。法伊茲·法拉基（Faezeh Falaki）： 驗證，資源提供。納斯林·莫斯塔吉（Nasrin Moshtaghi）： 撰寫 – 審稿與編輯，監(jiān)督，概念設計。穆罕默德·阿明·巴格里（Mohammad Amin Baghery）： 撰寫 – 初稿撰寫，可視化，驗證，軟件使用，方法學研究，數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)整理。馬赫迪耶·優(yōu)塞菲阿拉（Mahdieh Yousefiara）： 撰寫 – 審稿與編輯，資源提供，方法學研究，調查，概念設計。瑪麗亞姆·科什納米（Maryam Khoshnami）： 資源提供。穆罕默德·阿里·馬爾布比（Mohammad Ali Malboobi）： 數(shù)據(jù)可用性 原始讀段已存入Sequence Read Archive（SRA）數(shù)據(jù)庫，生物項目編號為PRJNA1394332 資助 本研究部分得到了伊朗國家遺傳工程與生物技術研究所（項目編號167和102M）和綠色轉基因技術發(fā)展公司（德黑蘭，伊朗）的資助。利益沖突聲明 ? 作者聲明他們沒有已知的可能影響本文工作的財務利益或個人關系。致謝 我們感謝伊朗國家遺傳工程與生物技術研究所的支持。
