《Virology》：Naturally occurring C-C and C-O-C-linked biflavonoids as potential inhibitors of the SARS-CoV-2 main protease (Mpro)
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自然產生的C-C和C-O-C連接二氫黃酮類化合物對SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）的抑制潛力通過整合計算方法（分子對接、DFT、分子動力學、MM/PBSA）系統評估。結果顯示C-C連接化合物（如amentoflavone和roostaflavone）在結合親和力、動態穩定性及電子性質方面優于C-O-C連接同類物（如hinokiflavone和ochnaflavone），但兩類均具抑制活性。藥代動力學分析顯示候選化合物低毒性，提示其作為抗COVID-19藥物開發潛力。
Suvankar Karmakar|Sk Aftabul Alam|Samiran Mondal
印度加爾各答Rammohan學院化學系，102/1-Raja Rammohan Sarani，W.B.，700009
摘要
嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）的主要蛋白酶（M
pro）對病毒復制至關重要，仍然是經過驗證的抗病毒藥物靶點。天然存在的雙黃酮類化合物，特別是那些具有C-C和C-O-C連接結構的雙黃酮類化合物，由于其結構多樣性和報道的抗病毒潛力而受到關注。在這項研究中，采用了一種綜合的計算機模擬方法來研究代表性雙黃酮類化合物對SARS-CoV-2 M
pro的抑制潛力。首先使用分子對接技術在M
pro的催化口袋內（PDB ID：
6LU7）篩選了C-C和C-O-C連接的雙黃酮類化合物庫，然后通過密度泛函理論（DFT）計算來評估其電子性質和化學反應性。進行了分子動力學模擬（MDS）以評估配體-M
pro復合物的結構穩定性，同時使用MM/PBSA方法估算結合自由能。通過主成分分析（PCA）和自由能景觀（FEL）分析來表征模擬過程中的關鍵運動和構象穩定性。觀察到與催化二聚體（His41和Cys145）以及周圍殘基（包括Glu166、His163和Gly143）的關鍵相互作用。比較分析顯示，C-C連接的雙黃酮類化合物，特別是amentoflavone和robustaflavone，比C-O-C連接的雙黃酮類化合物（如hinokiflavone和ochnaflavone）表現出更優的結合親和力和動態穩定性，盡管兩類化合物都顯示出抑制潛力。通過ADMET預測和Molinspiration分析評估了藥物相似性和藥代動力學特性，而ProTox-3的毒性評估表明排名靠前的化合物具有較低的預測毒性。總體而言，這些發現表明天然存在的雙黃酮類化合物，無論是C-C連接還是C-O-C連接的結構，都是抑制SARS-CoV-2 M
pro的有希望的候選物質，值得進一步實驗驗證。
引言
由新型嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）引起的2019冠狀病毒病（COVID-19）大流行仍然是一個重大的全球公共衛生挑戰，繼續推動全球范圍內開發能夠限制病毒復制和疾病嚴重程度的抗病毒藥物的密集努力。在病毒復制所必需的蛋白質中，SARS-CoV-2的主要蛋白酶（Mpro，也稱為3CLpro或非結構蛋白5，NSP5）是不可或缺的。這種半胱氨酸蛋白酶在超過11個保守位點上介導大型病毒多聚蛋白pp1a和pp1ab的蛋白水解切割，生成用于組裝復制-轉錄復合體（RTC）的非結構蛋白，從而驅動病毒基因組的復制和轉錄（Lee等人，2022；Jin等人，2020；V'kovski等人，2020；Chen等人，2025；Jia等人，2025）。Mpro通過由His41和Cys145組成的催化二聚體發揮作用，并識別一種獨特的人類蛋白酶中不存在的Leu–Gln↓(Ser/Ala/Gly)切割基序，從而降低了脫靶相互作用的風險（Ullrich和Nitsche，2020；Yaghi等人，2024）。由于這種獨特的底物特異性及其在復制周期中的核心作用，Mpro已成為選擇性抗病毒藥物開發的高價值靶點（Owen等人，2021）。此前已有幾類化合物被報道為SARS-CoV-2 Mpro的抑制劑，包括天然產物、小分子抗病毒藥物和基于結構的合成抑制劑，這表明Mpro是一個經過驗證且可成藥的治療靶點（Demir等人，2025；Oguz等人，2025；Türkan等人，2025；Cetin等人，2025）。
天然產物是抗病毒發現中化學多樣性豐富的結構來源，在這一領域中，黃酮類化合物尤其受到關注。雙黃酮類化合物——由兩個單體黃酮或黃酮醇通過偶聯形成的二聚體——廣泛分布于植物界，并展現出廣泛的生物活性，包括抗病毒、抗炎和抗癌作用（Kim等人，2008；He等人，2021）。雙黃酮類化合物包括C-C連接和C-O-C連接的結構類型，分別由amentoflavone型和hinokiflavone型化合物代表，它們不同的黃酮間連接方式可能影響分子柔韌性、靶點結合和生物活性。本研究中評估的雙黃酮類化合物可以分為圖1所示的兩種主要結構類型。第一種類型是C-C連接的二聚體，包括amentoflavone（1）、robustaflavone（2）和agathisflavone（3）等化合物。這些二聚體是通過兩個單體黃酮單元之間的直接碳-碳偶聯形成的，通常采用相對剛性的平面構象。第二種類型是C-O-C（醚鍵）連接的二聚體，其中兩個芹菜素單元通過氧橋連接。這一類別的代表性化合物包括ochnaflavone（4）、hinokiflavone（5）和delicaflavone（6）。這些不同的連接模式產生了不同的三維結構和理化特性，進而可能影響這些二聚體與蛋白質表面和活性位點的相互作用。越來越多的藥理學證據強調了雙黃酮類的廣泛治療潛力。在C-O-C連接的生物黃酮類中，amentoflavone表現出顯著的抗氧化、抗炎和中樞神經系統相關活性（Saroni Arwa等人，2015；Abdallah等人，2015；F. Wang等人，2015），而robustaflavone能強烈抑制乙型肝炎病毒的復制（Lin等人，1997），agathisflavone顯示出顯著的抗增殖效果（Konan等人，2012）。在C-O-C連接的雙黃酮類中，hinokiflavone具有抗氧化和保肝活性，與甘草苷聯合使用時效果更佳（G. Wang等人，2015；Abdel-Kader等人，2018），ochnaflavone具有抗炎、抗癌和抗菌特性（Ndoile，2018），delicaflavone則成為一種有前景的抗癌候選化合物（Patel，2024）。總體而言，雙黃酮類化合物表現出多樣的藥理活性，這主要歸因于C-C和C-O-C連接結構的獨特特征，這些特征賦予了它們與其他植物化學物質不同的生物特性。最近的研究文獻廣泛探討了雙黃酮類的生物潛力，許多研究在體外和體內模型中報告了其顯著的藥理活性（Chen等人，2022；Zhang等人，2022；Sim等人，2020；Lopes Andrade等人，2019；Patel，2024；Makhafola等人，2012）。
已有幾種雙黃酮類化合物被報道為SARS-CoV Mpro的潛在抑制劑。例如，amentoflavone是一種在Selaginella和Ginkgo物種中廣泛存在的C-C連接雙黃酮類化合物，它在SARS-CoV Mpro催化位點表現出較高的對接分數，并與催化殘基形成有利的氫鍵（Nguyen等人，2012）。研究表明，agathisflavone能夠在計算機模擬中與Mpro結合，并以微摩爾濃度抑制人類肺細胞中的SARS-CoV-2復制（Chaves等人，2022）。計算篩選還發現其他C-C連接的雙黃酮類化合物，如bilobetin、ginkgetin和sotetsu flavone也是有前景的配體，其預測的結合自由能超過了某些臨床測試的抗病毒藥物（Lokhande等人，2022）。相比之下，C-O-C連接的雙黃酮類化合物研究較少。例如，hinokiflavone表現出多種生物活性，包括抗病毒和酶抑制作用（Coulerie等人，2012），但其作為SARS-CoV-2 Mpro調節劑的潛力尚未得到充分探索。由于醚鍵連接與剛性的C-C連接相比具有不同的構象動態，系統比較這兩種化學類型可能會揭示SARS CoV-2 Mpro活性位點內的不同結合偏好。
總體而言，這些發現突顯了一個關鍵的知識空白：盡管雙黃酮類化合物作為天然Mpro抑制劑顯示出潛力，但連接化學（C-C與C-O-C）對結合模式和穩定性的影響尚未得到系統研究。
在這項研究中，我們采用了一種綜合的計算機模擬方法來研究天然存在的C-C連接與C-O-C連接的雙黃酮類化合物如何不同地調節SARS-CoV-2 Mpro活性位點。通過結合結構引導的對接、結合姿勢分析和分子動力學，我們研究了代表性的C-C型和C-O-C型結構，以繪制它們不同的相互作用特征，識別優選的活性位點亞位點和催化接觸點，并生成結構-活性假設，以指導生化測試或優化。這兩種連接類型的幾何約束和氫鍵模式預計會在Mpro內部產生可重復的二聚體取向差異，這可能有助于設計更有效、更具選擇性的抑制劑。這些見解可能有助于合理優先考慮和優化雙黃酮類化合物作為潛在抗病毒劑的應用。
材料與方法
使用AutoDock Vina結合Molecular Graphics Laboratory（MGL）工具進行了分子對接模擬，以評估選定的雙黃酮類配體與SARS-CoV-2 Mpro的結合相互作用。這種軟件組合有助于準確預測配體在目標蛋白活性位點的結合模式和親和力，從而為基于結構的藥物發現應用提供見解（Trott和Olson，2009；
對接驗證
為了評估對接協議的可靠性和準確性，使用從SARS-CoV-2 M
pro（PDB ID：
6LU7）中提取的共結晶配體N3，通過AutoDock Tools進行了重新對接，保持方法描述中的相同參數。計算得出N3的原始晶體構象與最佳對接姿勢之間的均方根偏差（RMSD）為0.646 ?（<3.0 ?）（圖2）。這一較低的RMSD值表明，使用
結論
本研究表明，天然存在的C-C連接和C-O-C連接的雙黃酮類化合物與SARS-CoV-2的主要蛋白酶（Mpro）形成了強效、穩定且持久的復合物，而Mpro是病毒復制的關鍵酶。這一結論得到了結合分子對接、分子動力學模擬、MM/PBSA結合自由能計算和電子性質分析的綜合計算機模擬策略的堅實支持。一致的優異對接分數
CRediT作者貢獻聲明
Suvankar Karmakar：研究、方法學、驗證、可視化。Sk Aftabul Alam：驗證。Samiran Mondal：概念化、數據管理、形式分析、資金獲取、研究、方法學、項目管理、資源協調、軟件使用、監督、驗證、可視化、初稿撰寫。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
本工作得到了DSTBT、GoWB（印度[1352(Sanc.)/STBT-11012(25)/46/2021-ST-SEC）、英國皇家化學會研究基金[R21–3846200522]和英國皇家化學會可持續實驗室基金[L23–2645701702]的支持。S.K.感謝DSTBT和GoWB提供的獎學金。S. Mondal感謝加爾各答Rammohan學院為研究提供的基礎設施支持。
