《Virology》：The influence of natural adaptation of the DCS-PK structure on the replication efficiency of Zika virus
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寨卡病毒（ZIKV）5'下游循環偽結（DCS-PK）的穩定性與其復制效率正相關，通過系統發育分析、RNA化學探針和結構預測發現，亞洲分離株的DCS-PK因內部凸起缺失而更穩定，進而增強病毒RNA復制能力，突變體證實該結構對復制至關重要。
齊廖|易格羅|景龍葉|志遠石|徐夢鋒|海濤盧|航宇周|俊宇吳|鐘宇劉
中國廣東省深圳市中山大學深圳校區醫學院感染與免疫研究中心，郵編518107
摘要
多項研究表明，不同分支或毒株的寨卡病毒（ZIKV）在細胞培養中的復制效率存在差異，但這些差異的分子基礎尚不清楚。本研究首次證明，5′-環化偽結（DCS-PK）序列的下游區域對于ZIKV的病毒RNA（vRNA）高效復制是必需的，這一功能與登革病毒生命周期中的類似。通過使用新開發的ZIKV復制子，我們發現DCS-PK序列在進化過程中發生了突變，其結構完整性得到了提升。結果表明，來自亞洲ZIKV毒株的更穩定的DCS-PK在促進vRNA復制方面比僅在早期分化出的非洲毒株中發現的較不穩定版本更有效。反向遺傳學方法生成的病毒突變體進一步證實了這一差異的重要性：攜帶穩定DCS-PK的MR766突變體在復制能力上優于野生型對照。此外，將不穩定的DCS-PK引入亞洲FSS13025毒株后，在包括人神經干細胞在內的多種體外模型中顯著抑制了病毒復制。總之，我們的工作揭示了DCS-PK的結構適應性對ZIKV復制能力的影響，突顯了順式作用RNA元件在自然選擇和病毒進化中的重要作用。
引言
寨卡病毒（ZIKV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）正黃病毒屬（Orthoflavivirus）[1]。該病毒于1947年首次在烏干達的Zika森林中被分離出來，但此后數十年間未受到足夠重視[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。然而自2007年以來，ZIKV在泛太平洋地區迅速傳播，引發了多起不同程度的疫情[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]，引起了廣泛關注[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。與其他黃病毒一樣，ZIKV的基因組是一種正鏈單鏈RNA分子，包含一個開放閱讀框（ORF），翻譯后產生約3,400個氨基酸殘基的多聚蛋白前體。該多聚蛋白經病毒和宿主蛋白酶的蛋白水解處理后，可生成三種結構蛋白（衣殼/C、前膜/prM和包膜/E）以及七種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）[25]。
自發現以來，ZIKV在大約80年的傳播過程中分化為多個不同的系統發育群[26]、[27]、[28]。盡管ZIKV的完整進化圖譜尚未完全明確，但普遍認為非洲分離的毒株（AF）與亞太地區傳播的毒株（稱為亞洲毒株，AS）在系統發育上存在差異[28]、[29]、[30]。此外，AF和AS毒株在細胞培養中的復制效率和動物模型中的毒力也存在差異[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。雖然已證明C蛋白中的某個遺傳特征是造成這些差異的關鍵因素[27]，但其他病毒決定因素（包括病毒蛋白變異和順式作用RNA元件）仍有待研究。
許多在蚊媒黃病毒（MBFVs）中保守的順式作用RNA元件[43]、[44]在ZIKV RNA合成中起著不可或缺的作用。具體而言，5′-莖環A（SLA）與NS5和病毒RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）結合，將其引導至3′末端，從而啟動負鏈RNA的合成[45]、[46]、[47]、[48]、[49]。三對保守的互補基序——5′-3′上游AUG區域（UARs）[50]、[51]、[5′-3′下游AUG區域（DARs）[51]、[52]、[53]以及5′-3′環化序列（CSs）[54]、[55]——有助于病毒基因組的環化并保持5′和3′末端的接近。值得注意的是，黃病毒基因組的環化是一個精細調節的過程，必須維持線性RNA和環狀RNA之間的平衡才能實現高效復制[51]、[56]、[57]、[58]、[59]。位于5′-CS上游的cHP結構對核糖體識別起始密碼子和病毒RNA（vRNA）復制至關重要[60]。5′-CS下游的序列（5′-DCS）也具有功能性[62]、[63]、[64]。先前的研究表明，5′-DCS區域在II亞組的MBFVs中可折疊成三莖偽結（DCS-PK），而在I亞組的MBFVs中則形成簡單的發夾結構后接A富集區[56]。這些結構對高效vRNA復制至關重要，并參與基因組環化的調控。ZIKV屬于II亞組的MBFVs，先前的研究也表明其C編碼區含有DCS-PK[59]、[63]、[64]、[65]、[66]。我們的初步觀察發現，原型MR766與幾種現代亞洲毒株的DCS-PK序列存在差異，這促使我們探討DCS-PK結構是否發生了與進化相關的變化，從而影響病毒復制特性。
通過結合選擇性2′-羥基�；ㄍㄟ^引物延伸和突變分析SHAPE-MaP）、RNA結構預測及復制子實驗[67]、[68]，我們證實ZIKV基因組中含有類似登革病毒的功能性DCS-PK元件。進一步通過系統發育分析和序列比較確認，DCS-PK在進化過程中發生了適應性突變。值得注意的是，早期分化出的AF毒株中的DCS-PK內部凸起結構在其他ZIKV分支中消失了，這可能是DCS-PK結構完整性提高的主要原因。利用多種ZIKV復制子和傳染性克隆進行的反向遺傳學研究表明，DCS-PK穩定性的增強使其在促進vRNA復制方面更有效，進而提高了病毒傳播能力和/或復制適應性。本研究揭示了ZIKV不同系統發育群間復制差異的重要RNA決定因素。
細胞培養和病毒
BHK-21細胞（ATCC, CCL-10）在添加了5%胎牛血清（FBS, Nobimpex Biotech）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM, Thermo Fisher Scientific）中培養。Huh-7細胞（RRID CVCL_0336）在含有4 g/L葡萄糖、10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM中培養。JEG-3細胞的培養使用添加了1%非必需氨基酸的最小必需培養基（MEM, Procell）。
利用非洲分離株衍生的復制子對ZIKV DCS-PK進行表征
以往關于ZIKV復制和傳播的研究主要基于現代亞洲毒株或原型MR766毒株。相比之下，只有少數反向遺傳學研究基于其他非洲毒株[26]、[85]、[86]。為了研究DCS-PK在ZIKV RNA復制中的作用，我們首先基于1984年從塞內加爾伊蚊中分離出的Dakar-41662毒株構建了一個表達Renilla熒光素酶（Rluc）的復制子（圖1A）。
討論
順式作用RNA元件在（+）單鏈RNA病毒的生命周期中起著關鍵作用。通過使用新開發的復制子系統，我們證實DCS-PK結構對ZIKV的高效復制也是必需的，這與登革病毒的研究結果一致[63]。最近的一項基于報告基因ZIKV的研究表明，DCS-PK的Stem 1對ZIKV在蚊子細胞中的復制至關重要。另一方面，雖然刪除整個Stem 2會導致...
結論
本研究通過結合RNA化學探測、RNA結構預測和反向遺傳學方法，證實DCS-PK能夠增強ZIKV RNA復制，其功能依賴于其三莖偽結的三級結構。此外，我們提供了證據表明，DCS-PK在進化過程中的結構適應性提高了其促進vRNA復制的效率，揭示了順式作用RNA元件的重要作用。
CRediT作者貢獻聲明
志遠石：資源、方法學。景龍葉：寫作——審稿與編輯、研究、數據管理。徐夢鋒：研究、寫作——審稿與編輯。海濤盧：研究、方法學。俊宇吳：寫作——審稿與編輯、監督、資源管理、方法學、資金獲取。航宇周：寫作——審稿與編輯、方法學。鐘宇劉：寫作——審稿與編輯、初稿撰寫、可視化、監督、方法學、資金獲取。
利益沖突
作者聲明沒有利益沖突。
競爭利益聲明
? 作者聲明以下可能被視為潛在競爭利益的財務利益/個人關系：第二和第三種情況無需聲明任何利益。
致謝
作者感謝德克薩斯大學醫學分校的Pei-Yong Shi教授和中國科學院動物研究所的Zheng Ai-Hua教授分別提供的FSS13025和原始MR766傳染性克隆。同時感謝中國科學院病毒學研究所的Zhang Bo教授和病原體國家重點實驗室病毒學系的Qin Cheng-Feng教授提供的SZ01復制子質粒。
