《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Development of a high ethyl hexanoate-producing strain via ARTP mutagenesis and fermentation optimization using agricultural by-products
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乙基己酸酯高產菌株阿辛托體貝雷辛氏菌B-6經ARTP誘變后得突變株4-8，產量提升129.38%達52.00 mg·L?1。通過優化培養基配方，利用淀粉、 peptone和NaCl的低成本配方使產量增至67.00 mg·L?1，進一步結合農業副產品（如秸稈水解液和糖蜜）進行發酵條件優化，最終實現96.00 mg·L?1的高效生產。該研究建立微生物定向改良與農業廢棄物資源化聯用的高值酯類生物制造體系。
李玉玲|王志強|萬仁志|曾欣|辛冰月|張彪|喬杰|趙德印|趙明濤|謝友玉|姜莊莊|曾華為|張亮
安徽省污染物敏感材料與環境修復重點實驗室/淮北師范學院生命科學學院農產品生物加工重點實驗室，中國淮北235000
摘要：
在本研究中，從濃香型大曲中分離出一種能夠產生己酸乙酯的菌株。通過16S rDNA測序進行分子鑒定，確認其為Acinetobacter bereziniae B-6。經過大氣和室溫等離子體（ARTP）誘變處理后，獲得了一株名為4-8的突變體，其己酸乙酯產率為52.00 ± 2.00 mg·L-1，比親本菌株提高了129.38%。營養需求分析表明，去除酵母提取物并補充5 g·L-1可溶性淀粉后，產率提高到67.00 ± 2.00 mg·L-1。隨后，配制了一種主要由淀粉、蛋白胨和NaCl組成的低成本培養基，使產率進一步提高至72.00 ± 3.00 mg·L-1-1，提高了33.3%。當添加0.6%小麥秸稈水解物并在pH 7.0、40°C下發酵48小時后，產率增加到95.00 ± 2.00 mg·L-1，提高了31.9%。本研究提供了一種高產己酸乙酯的微生物菌株以及一種利用農業副產品進行風味酯生物合成的低成本發酵策略。
引言
己酸乙酯是濃香型白酒中的關鍵香氣化合物，其含量直接決定了白酒的香氣特征和質量等級（Hong, J.等人，2023；Xu, Y.等人，2022）。作為占據白酒市場約70%的主導香氣類型，提高己酸乙酯的合成效率具有重要的工業意義。在傳統的固態發酵過程中，己酸乙酯主要通過己酸和乙醇的酯酶催化反應生成（Liu, G.等人，2023）。然而，當前的生產系統普遍面臨己酸乙酯含量較低的技術挑戰。與能耗高且選擇性較低的化學合成方法（Zhang, C.等人，2023）以及產物復雜、周期較長的全細胞發酵方法（Guan, T.等人，2023）相比，酶催化方法由于其反應條件溫和、催化特異性高、副產物少且符合綠色制造原則（Wu, Z.等人，2021），被認為是一種更有前景的工業途徑。因此，通過育種或工程手段開發高產己酸乙酯的優良微生物菌株，對于提高這種風味酯的生物合成效率至關重要。
然而，酶催化途徑的工業化面臨兩個主要挑戰：首先是天然酯酶產生菌株的性能有限，導致催化能力不足（Xu, C.等人，2020）；其次是傳統發酵培養基依賴于酵母提取物和蛋白胨等昂貴成分，導致生產成本較高（Karray, F.等人，2021）。為了解決這些問題，本研究提出了一種綜合策略，旨在同時改進目標菌株和發酵原料，以建立高效、經濟且可持續的酯酶介導的己酸乙酯生產系統。
在微生物育種中，大氣和室溫等離子體（ARTP）誘變技術因其高突變率和操作安全性等優點而被廣泛用于工業微生物的改良（Khan, S. A.等人，2015；Liu, K.等人，2020）。在發酵原料方面，利用秸稈等農業副產品作為培養基成分有助于資源循環和過程可持續性（Georganas, A.等人，2023；Guo, T.等人，2015）。現有研究表明，小麥秸稈水解物和糖蜜可以作為多種微生物發酵過程中的替代碳源（Alvarez-Guzmán, C. L.等人，2020）。例如，Salamony等人利用重組Bacillus subtilis開發了一種固態發酵系統，實現了80%的雞羽毛降解，并產生了高活性的蛋白酶和可溶性蛋白質（El Salamony, D. H.等人，2024）。盡管這些研究并未直接針對酯酶介導的己酸乙酯合成，但它們在原料利用和過程優化方面的方法為基于農業廢棄物的高效酯酶催化發酵過程提供了寶貴見解。
盡管先前的研究嘗試通過菌株篩選（例如Staphylococcus epidermidis）（Xu, P.等人，2023）和代謝工程（例如酵母菌株α5-FAS1ΔOPI1）（Chen, Y.等人，2016）來提高己酸乙酯的產率，但現有系統的生產水平仍無法滿足工業需求。此外，結合高效誘變育種和農業廢棄物資源利用的綜合研究相對缺乏。因此，本研究設計了一種多階段策略，包括從傳統發酵起始菌中篩選野生菌株、ARTP誘導的誘變、開發基于農業副產品的低成本培養基以及系統優化發酵條件，以建立高效的酯酶介導的己酸乙酯生產系統。這種方法不僅有助于獲得高產己酸乙酯的菌株并實現白酒風味的定向調節，還為農業副產品的價值化和綠色可持續生物制造提供了綜合解決方案。
材料
實驗中使用的所有有機酸，包括無水乙醇、丁酸、己酸、乳酸和醋酸，均為分析級，購自中國上海的中藥化學試劑有限公司。小麥秸稈粉從淮北師范學院附近的當地農貿市場獲取，糖蜜由當地糖廠提供。
原料預處理
小麥秸稈水解物的制備方法參考了（Liu, G.等人）的報告。
篩選高酯化能力的菌株
從大曲樣本中初步分離出50個具有明顯菌落的細菌菌株，表明其具有酯酶或脂肪酶活性。根據菌落直徑與暈圈直徑的比例（D/d），選出了18個具有較高三丁酸酯水解活性的菌株進行進一步評估（表1）。其中，A-4、C-8和D-7菌株的D/d值最高（均≥1.70），表明其酯化能力較強。
為了評估它們的實際酯化能力，選擇了10個菌株
討論
本研究成功分離并鑒定出一種具有高酯化能力的Acinetobacter bereziniae菌株。該屬菌株在生物修復（例如石油烴、酚類和重金屬的降解）和生物合成領域引起了廣泛關注，特別是它們能夠產生工業酶（如脂肪酶）和高價值化合物（Nimkande, V. D.等人，2023）。例如，Ahmed等人使用脂肪酶EH28
結論
本研究從大曲中分離出一種高產己酸乙酯（22.67 ± 1.53 mg·L-1）的菌株，并通過16S rDNA分析鑒定為Acinetobacter bereziniae B-6。ARTP誘變得到了一個更優的突變體4-8，其己酸乙酯產率為52.00 ± 2.00 mg·L-1，比親本菌株提高了約129%。后續的發酵優化采用了基于淀粉和蛋白胨的低成本基礎培養基，使產率進一步提高。
CRediT作者貢獻聲明
曾華為：項目管理、方法論、資金獲取、概念構思。李玉玲：寫作 – 審稿與編輯、初稿撰寫、驗證、方法論、調查、數據分析、概念構思。姜莊莊：數據可視化、數據管理。萬仁志：驗證、調查、數據分析。張亮：寫作 – 審稿與編輯、驗證、監督、資源提供。王志強：寫作 – 審稿與編輯、數據分析
未引用的參考文獻
Costa等人，2021；Wang等人，2024；Zhang等人，2023。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
資助
本研究得到了安徽省教育廳的重點自然科學研究項目（項目編號：2024AH051691和2024AH051699）以及國家大學學生創新與創業項目（項目編號：202410373010）的資助。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
