《Biochemical Pharmacology》：Novel 1,2,3-triazole-based compound triggers apoptosis through DNA damage response involving ATM/ATR signaling in liver cancer cells
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三唑類化合物KJ-9通過誘導肝癌細胞系（HepG2、HCCLM3）凋亡及激活DNA損傷修復通路（ATM/ATR），抑制細胞周期G2/M期阻滯，產生顯著抗增殖活性。抗氧化劑NAC可逆轉其部分效應，提示ROS介導的AKT通路抑制是作用機制之一。
姚璐|程思思|張藝穎|李怡穎|劉玲
河南科技大學基礎醫學與法醫學學院，中國洛陽開元路263號，471003
摘要
1,2,3-三唑取代的卡博替格韋類似物（KJ-9）被開發為潛在的抗腫瘤劑進行研究。該新型類似物對多種人類癌細胞系表現出顯著的抗增殖活性，尤其是對HepG2和HCCLM3肝癌細胞系效果顯著，因為它能顯著降低這些細胞的克隆形成能力并誘導細胞凋亡。此外，KJ-9處理還能增加Bax與Bcl-2蛋白的比例，并激活切割型caspase-9、caspase-3和聚ADP-核糖聚合酶（PARP）。同時，KJ-9處理會阻斷細胞周期（G2/M期），增加DNA損傷水平，并導致組蛋白變體H2AX（γ-H2AX）蛋白的積累。此外，p-ATM和p-ATR蛋白及其下游效應因子p-CHK1和p-CHK2也顯著上調。KJ-9處理還增加了腫瘤抑制蛋白p53的磷酸化水平，并抑制了PI3K/AKT通路的成分。盡管KJ-9對AKT磷酸化沒有顯著影響，但ATM/ATR抑制劑CGK733能夠顯著逆轉KJ-9引起的p-ATM、p-ATR、p-p53和γ-H2AX的上調以及caspase-3的激活。此外，KJ-9處理會產生更多的活性氧（ROS）。添加抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，ROS被抑制，從而提高了p-AKT的水平，降低了p-ATM、p-ATR、p-p53、切割型caspase-3和γ-H2AX的水平。這些發現表明，KJ-9通過促進氧化應激來進一步抑制AKT的激活，同時激活ATM/ATR通路，導致p53積累、持續的DNA損傷反應、G2/M期細胞周期停滯和HepG2細胞及HCCLM3細胞的凋亡。
引言
肝癌是最常見的原發性肝臟惡性腫瘤，死亡率很高。主要致病因素包括慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、黃曲霉素暴露、長期飲酒、高血糖（糖尿病）和非酒精性脂肪肝病[1]。這種疾病通常具有隱匿性，但生物侵襲性很強，常常在晚期才被診斷出來。目前的治療方法，包括手術、放射治療、化療和介入放射學手段，在治療復發性或轉移性肝癌方面效果有限[2]。肝癌的一個特征是染色體不穩定，這為腫瘤發生、疾病進展和治療抵抗提供了分子基礎[3]。
DNA損傷會導致基因組不穩定。正常真核細胞具有一系列稱為DNA損傷響應（DDR）的途徑，通過檢測DNA結構缺陷并觸發各種信號級聯反應來保護基因組穩定性[4]。如果修復失敗，細胞會啟動導致凋亡或不可逆衰老的程序以降低致癌能力。DDR網絡中的兩個關鍵蛋白激酶是ataxia-telangiectasia突變型（ATM）和ataxia-telangiectasia和Rad3相關型（ATR）[5]。這兩種酶都屬于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）相關激酶家族，它們通過響應不同類型的DNA損傷來調節細胞周期進程。ATM主要響應嚴重的DNA損傷類型——雙鏈斷裂（DSBs）。當檢測到這些斷裂時，ATM會迅速被激活，隨后通過磷酸化其靶標（如檢查點激酶2（CHK2）或p53），使細胞周期暫時停滯在G2/M期[6]。這為細胞提供了自我修復的時間。相比之下，ATR主要處理單鏈斷裂（SSBs）、復制叉停滯和紫外線誘導的損傷，其激活依賴于復制過程。ATR激酶在細胞應激或復制叉結構變化時被激活。一旦激活，它會調節其下游底物（如CHK1），導致S期或G2/M期停滯[7]。
化療藥物通過不同的機制損傷DNA。它們可以阻止腫瘤細胞增殖并可能誘導細胞凋亡。例如，拓撲異構酶抑制劑會導致鏈斷裂，烷化劑會產生堿基錯配或交聯，順鉑會誘導DNA鏈交聯[8]。當DDR相關分子（如ATM或ATR）被調節時，惡性細胞對DNA損傷劑變得更加敏感，與標準細胞毒性藥物或放射治療聯合使用時效果更佳。
含有氮原子的雜環化合物是設計抗腫瘤藥物的重要化合物。1,2,3-三唑結構穩定，還能與生物靶標形成氫鍵。其平面結構穩定性使其能夠很好地與生物大分子（如DNA）結合[9]。含有這一結構的衍生物可以插入腫瘤細胞的DNA堿基對之間，干擾關鍵的細胞過程（如DNA復制和基因表達），從而導致DNA損傷。所有這些特性使得1,2,3-三唑成為優秀的骨架結構，如果與其他生物活性物質結合使用的話。例如，1,2,3-三唑-嘧啶雜化物可以克服ATP結合盒亞家族B成員1（ABCB1）介導的多藥耐藥性[10]。三甲基苯基-1,2,3-三唑雜化物是作為微管組裝阻滯劑的化合物，其中化合物19c對多種癌細胞具有強烈的抗增殖活性（IC50值為0.13至1.74 μM）[11]。1,2,3-三唑環系在多個領域有廣泛應用。卡博替格韋是一種抗HIV藥物，可抑制病毒整合酶，防止病毒DNA插入人體細胞；它具有較低的肝毒性，長期使用時耐受性良好[12]。基于這些證據，我們選擇了1,2,3-三唑環結構，以提高其抗癌活性。KJ-9（6-甲氧基-3-甲基-5,7-二氧-N-(3-(1-(2-(三氟甲氧基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)-2,3,5,7,11,11a-六氫雜環[3], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]吡啶[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]吡嗪-8-羧酰胺）表現出強烈的抗腫瘤活性。我們的先前研究表明，它在48小時內的半最大抑制濃度（IC50）為5.06 ± 0.06 μM[13]。這些結果表明KJ-9可能是治療肝癌的有希望的候選藥物。
在這項研究中，KJ-9被確認為具有抗腫瘤藥物開發潛力的多功能骨架結構。本研究旨在闡明KJ-9如何通過ATM/ATR通路干擾DNA損傷修復。使用HepG2和HCCLM3細胞評估DNA損傷、細胞凋亡和DDR通路中的蛋白質表達。還應用了裸鼠異種移植模型，以便觀察肝臟組織的病理變化并分析與DNA修復和凋亡相關的蛋白質。這些發現為肝癌的化療策略提供了新的見解。
材料
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）、鏈霉親和素-生物素（SP）免疫組化試劑盒和N-乙酰半胱氨酸（NAC）購自Solarbio科技有限公司（北京，中國）。CGK733由Ambeed生物技術有限公司（上海，中國）提供。TUNEL凋亡檢測試劑盒（紅色，Elab Fluor? 594）、Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒和預染蛋白標記物（8–180 kDa）來自KeyGEN生物技術有限公司（南京，中國）。
KJ-9對腫瘤細胞和正常細胞存活率的影響
KJ-9的結構如圖1A所示。在不同濃度的KJ-9處理48小時后，HepG2和HCCLM3細胞的抑制率呈劑量和時間依賴性增加（圖1B, C）。KJ-9顯著抑制了多種癌細胞的增殖，包括HepG2、HCCLM3、HeLa、KYSE-150和A549細胞。然而，IC50值（圖1D）顯示KJ-9對HepG2和HCCLM3的抑制作用比其他測試細胞更強。
討論
在本研究中，我們發現KJ-9可以有效抑制HepG2和HCCLM3細胞的生長，降低它們的克隆形成能力并誘導細胞凋亡。其對正常細胞的低毒性表明KJ-9具有選擇性作用和潛在的治療價值。
細胞凋亡有助于防止腫瘤形成，通常由DNA損傷誘導。Norbury和Zhivotovsky的研究表明，DNA損傷誘導的凋亡可以防止惡性轉化[14]，Wang也證實了這一點。
CRediT作者貢獻聲明
姚璐：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，驗證，數據分析，概念構思。
程思思：撰寫 – 審稿與編輯，方法學，數據分析。
張藝穎：撰寫 – 審稿與編輯，方法學，數據分析。
李怡穎：撰寫 – 審稿與編輯，方法學，數據分析。
劉玲：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，驗證，項目管理，資金獲取，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究得到了河南科技大學的科學研究基金（編號：4020/13480023）和河南科技大學的學生研究培訓計劃（編號：266）的支持。
倫理聲明
動物實驗方案獲得了河南科技大學生命科學倫理委員會的批準。研究遵循當地法律法規和機構要求進行。
