《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》：Disulfide-mediated dimerization stabilizes pyruvate kinase of
Cryptosporidium parvum: Insights into unique structural assembly and functional implications
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隱孢子蟲吡ruvate激酶（CpPyK）通過Cys26與Cys312形成的二硫鍵維持二聚體結構，影響其熱穩定性和酶活性。突變體Cys312Ser導致二硫鍵斷裂，mCpPyK呈現多聚態、熱穩定性降低（熔點從67℃降至36-60℃），且催化效率下降30%。該研究揭示了CpPyK二硫鍵連接對結構穩定性和代謝調控的重要性。
Katherine L. Hayden | Norbert Schormann | Rachael Motamed | Juan Campos | Sydney Bates | Riley Watkins | Anna Katherine Eastman | Sierra Nickelberry | Lee Bowman | Debasish Chattopadhyay
美國阿拉巴馬州蒙蒂瓦洛市蒙蒂瓦洛大學生物系、化學系、數學系和計算機科學系
摘要
Cryptosporidium parvum 是一種主要依靠糖酵解產生能量的原生動物寄生蟲。其丙酮酸激酶（CpPyK）催化糖酵解的最終步驟，該酶含有由兩個CpPyK單體上的Cys26和Cys312之間的分子內二硫鍵（SS）形成的共價交聯二聚體。這種橋接結構在CpPyK中是獨特的，在其他已知的丙酮酸激酶中并不存在。為了研究這種SS介導的二聚化對酶結構和功能的影響，我們生成了一種Cys312被替換為絲氨酸的突變體（mCpPyK），并比較了這種突變體與野生型CpPyK（wtCpPyK）的結構和動力學特性。
野生型CpPyK以四聚體形式存在，而mCpPyK則存在于多種狀態中，包括四聚體形式。差示掃描熒光法（DSF）顯示，野生型CpPyK在約67°C時發生單一熔解轉變；然而，mCpPyK在解折疊過程中表現出多個轉變點，分別位于36°C、48°C和60°C。向mCpPyK中添加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、葡萄糖-6-磷酸（G6P）和腺苷單磷酸（AMP）等效應物后，這些轉變點變得更加明顯，且mCpPyK的熔解溫度升高至約65°C。對mCpPyK的酶動力學分析表明，其對PEP的催化效率降低了約30%（野生型為kcat約378 min?1，突變型為約269 min?1），同時其別構響應性也有所不同。這些結果表明，CpPyK中的SS交聯有助于維持其結構完整性，并調節其別構響應性。我們認為這種共價適應性有助于在環境壓力下保護酶的功能，從而為寄生蟲提供了進化優勢。
引言
Cryptosporidium parvum 是一種屬于頂復門（apicomplexa）的重要醫學寄生蟲。[1]它可通過受污染的食物和水傳播，感染人類和其他動物的小腸。雖然健康成年人的感染通常具有自限性，但在免疫功能低下的人群和新生兒中可能導致嚴重的、甚至致命的胃腸道疾病和腹瀉，即隱孢子蟲病。[1],[2]目前，僅有一種中等效力的藥物尼塔唑沙星（Nitazoxanide）被批準用于治療免疫功能正常者的隱孢子蟲病。[3]然而，該藥物對幼兒、免疫功能低下患者和牲畜幾乎無效，這凸顯了尋找新治療靶點的緊迫性。[4],[5]
一些傳統的抗寄生蟲藥物靶點在
Cryptosporidium 中并不存在。但由于這種寄生蟲缺乏功能性線粒體，必須依賴糖酵解來產生能量[6]，因此糖酵解酶可能是開發抗隱孢子蟲藥物的潛在靶點。丙酮酸激酶（PyK）是糖酵解途徑中的三個調節酶之一。PyK催化糖酵解的最終限速步驟，將磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）中的磷酸基團不可逆地轉移到ADP上，生成丙酮酸（PA）和ATP。PyK的活性受到底物和多種別構效應物的調控。[7],[8],[9]值得注意的是，一種用于激活人類紅細胞PyK的化合物PYRUKYND（mitapivat）已被批準用于治療PyK缺乏引起的溶血性貧血。[10]此外，選擇性抑制人類PyK異構體的化合物也在被研究用于開發抗癌藥物。[11]
盡管PyK在進化上具有保守性，但
C. parvum 的PyK（CpPyK）在其氨基酸序列和結構上具有新穎特征。使用CpPyK蛋白序列（Q5CSM7）進行BLASTp搜索（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）后發現，其與其它
Cryptosporidium 物種的PyK有99–82%的相似性，與最接近的非
Cryptosporidium 生物
Besnoitia besnoiti 的PyK有57%的相似性（見圖S1）。[9]通過ClustalW進行的多序列比對顯示，CpPyK與人類PyK（hPyK）的多種異構體有約40%的相似性（見圖S2A）。[12]此外，不同種類的隱孢子蟲PyK的半胱氨酸含量約為4%，而hPyK異構體的半胱氨酸含量為1.7–2.1%。在CpPyK的21個半胱氨酸殘基中，Cys26和Cys312參與了獨特的分子內二硫鍵（SS）連接，形成了交聯二聚體。[8],[9>據我們所知，其他生物中尚未描述過類似的PyK二聚體。CpPyK的這些獨特特性使其成為潛在的藥物靶點。最近的研究結果表明，CpPyK的抑制劑在體外和體內均能有效抑制隱孢子蟲病，并且對宿主細胞無毒。[13]這強調了詳細研究CpPyK結構與功能的必要性。
盡管CpPyK含有21個半胱氨酸殘基，但只有四個（Cys26、Cys312、Cys513和Cys517）參與了SS鍵的形成。除了CpPyK四聚體中的四個分子內SS鍵外，在ADP結合構象下，CpPyK的效應物環中還存在一個Cys513和Cys517之間的分子內SS鍵。[9]在apo-CpPyK結構中，效應物環區域是無序的。[8]在其他PyK中（見圖S2A），Cys513和Cys517似乎并不存在。盡管在某些PyK（例如hPyK異構體）中可能非常罕見地存在類似的半胱氨酸殘基，位于CpPyK中Cys26的位置，但SS交聯可能是物種特異性的適應性特征。系統發育分析表明，隱孢子蟲和其他頂復門生物（如Plasmodium和Besnoitia besnoiti ）的PyK是從一個共同的祖先序列分化出來的，形成了獨立的分支（見圖S2B）。這一結構特征對CpPyK的穩定性、組裝和別構調節的影響值得進一步研究。
為了揭示CpPyK四聚體中新型分子內SS鍵交聯的功能作用，我們生成了一種突變體（mCpPyK），其中Cys312被替換為絲氨酸殘基。形成共價交聯二聚體需要Cys26和Cys312同時參與。因此，任何一個殘基的突變都足以阻止SS鍵的形成。本文報告了野生型（wtCpPyK）和mCpPyK的比較分析，重點關注它們的動力學參數、熱穩定性和調節特性。
表達與純化
野生型重組CpPyK在E. coli BL21(DE3)細胞中表達，并按照先前描述的方法進行純化。[8]在mCpPyK構建體中，Cys312被替換為絲氨酸殘基。由于分子內SS鍵的形成需要兩個半胱氨酸殘基，因此Cys312被替換為絲氨酸就足以消除共價二聚化。修改后的序列被克隆到pQE61載體（Qiagen）的BamHI/HinIII限制位點中，并插入了N端的6xHis標簽和TEV切割位點（ENLYFQG）。
凝膠過濾色譜
通過尺寸排阻色譜分析，野生型CpPyK以單一的四聚體形式洗脫。[9]而mCpPyK則表現出多個峰，洗脫體積范圍為40–70 mL（見圖S3a），表明存在不同的寡聚態。在相似條件下，過氧化氫酶（分子量234 kDa）的洗脫體積為65–70 mL（峰65.6 mL），甲狀腺球蛋白（分子量669 kDa）的洗脫體積為45–50 mL。
討論
C. parvum 卵囊對環境壓力（如化學消毒劑、干燥和極端溫度）具有很強的抵抗力。它們可以在高達30°C的溫度下存活數周，甚至在-20°C下也能短暫存活，只有在50–60°C以上或-20°C以下才會迅速失活。[25],[26]在適宜條件下，卵囊可以在土壤和水中存活數月。[27>這種顯著的適應性反映了寄生蟲核心代謝機制的適應性。
CRediT作者貢獻聲明
Katherine L. Hayden： 撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、研究監督、方法論設計、數據分析、概念構建。
Norbert Schormann： 撰寫 – 審稿與編輯、數據可視化、方法論設計、數據分析、概念構建。
Rachael Motamed： 撰寫 – 審稿與編輯、研究實施、數據分析。
Juan Campos： 撰寫 – 審稿與編輯、研究實施、數據分析。
Sydney Bates： 研究實施、數據分析。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
作者感謝參與該項目的研究人員的貢獻。
