《Bioresource Technology》：Continuous directed evolution of isoflavone synthase to mitigate feedback inhibition: combine use of a novel developed bacteria-based biosensor and high-throughput droplet sorting
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大豆苷元微生物合成受異黃酮合成酶（IFS）反饋抑制限制，本研究開發基于Bradyrhizobium japonicum FrrA轉錄因子的生物傳感器，結合微流控分選和T7RNA聚合酶-脫氨酶融合蛋白連續定向進化策略，成功篩選出Trifolium pratense IFS的突變體M6，其抑制常數提高6.6倍，結合親和力降低，使大豆苷元產量提升3.1倍。分子動力學模擬揭示關鍵突變位點的構象穩定機制。
王哲|趙丹山|Ghada Said Baghdady|王繼遠|戴一強|徐偉民|王道英|王月彤|夏秀東
江蘇省農業科學院農產品加工研究所，南京 210014，中國
摘要
染料木黃酮（Genistein）是一種具有治療氧化應激、心血管疾病和癌癥潛力的生物活性異黃酮，但在微生物生物合成過程中，由于異黃酮合成酶（IFS）的產物反饋抑制作用，其生產受到限制。為了克服這一瓶頸，開發了一種基于生物傳感器的連續定向進化平臺。具體而言，利用Bradyrhizobium japonicum的轉錄因子FrrA構建了一種特異性染料木黃酮生物傳感器，該傳感器能夠區分染料木黃酮及其前體（2’S）-naringenin。通過對生物傳感器進行系統優化，在抑制染料木黃酮濃度下消除了背景熒光，同時保持了其對產物高水平的高響應性，從而實現了高通量篩選中的精確檢測。通過將這種生物傳感器與液滴微流控分選技術結合，通過脫氨酶-T7 RNA聚合酶融合介導的連續進化，生成了高質量的Trifolium pratense IFS（TpIFS）突變體文庫，并對其進行了篩選。該方法成功鑒定出了TpIFSM6，這種突變體表現出6.6倍的產物抑制常數降低和3.8倍的染料木黃酮結合親和力降低。因此，使用TpIFSM6獲得的染料木黃酮產量是野生型的3.1倍。分子動力學模擬顯示，I187R和F303A突變阻止了抑制劑誘導的催化I-螺旋構象位移。這項工作建立了一種可推廣的高通量篩選策略，以減輕酶的反饋抑制，促進了植物來源天然產物的穩健生物合成。
引言
染料木黃酮是一種主要存在于豆科植物中的異黃酮，與其前體（2’S）-naringenin相比，具有顯著的雌激素活性（Petry等人，2020年）。研究表明，它在緩解氧化應激（Li等人，2022a年；dos Petry等人，2020年）、更年期綜合征（Tan等人，2025年）、心血管疾�。╓ei等人，2022年）、骨質疏松癥以及某些癌癥（Geng等人，2022年；Neuberger等人，2023年）方面具有顯著的治療潛力。傳統的植物提取方法受到較長栽培周期、嚴格的農藝要求以及天然含量低的限制。相比之下，微生物生物合成提供了一種可持續的替代方案，具有更高的產量、更短的生產周期和更少的環境限制（H. Li等人，2022年）。染料木黃酮從（2’S）-naringenin的生物合成由細胞色素P450酶異黃酮合成酶（IFS）催化（Hwang等人，2024年；Liu等人，2021年）。然而，IFS的活性受到其產物染料木黃酮的反饋抑制，這是防止代謝物積累的常見機制（Han等人，2016年；Leong和Hanson，2023年）。在微生物宿主中，這種反饋循環成為生產的主要瓶頸，因為積累的染料木黃酮濃度會抑制IFS活性，從而導致產量下降（Chemler等人，2010年）。我們之前的研究證實了這種直接的抑制效應，強調它是高效合成染料木黃酮的關鍵障礙（Wang等人，2022a年）。目前，對于染料木黃酮與IFS之間相互作用的理解仍然有限，特別是在它們的結合位點方面，這給合理和半合理酶設計帶來了挑戰。定向進化策略可以通過全局突變識別關鍵域，并利用遠端突變的優勢，為減輕酶的反饋抑制提供了一種有效方法（Sun等人，2023年；Zhang等人，2025年）。
傳統的定向進化依賴于體外基因多樣化，但往往受到勞動密集型協議和由于DNA轉化效率低下導致的序列多樣性有限的限制（Song等人，2025年）。為了克服這些限制，已經在E. coli中建立了體內連續定向進化系統，利用穩定的正交復制（Diercks等人，2025年；Song等人，2025年；Tian等人，2024年）。該系統的核心機制是使用胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶分別誘導隨機的C到T和A到G突變（Mengiste等人，2024年；Park和Kim，2021年）。為了實現靶向突變，這些脫氨酶被融合到T7 RNA聚合酶（T7RNAP）中，使其特異性地作用于目標基因（Moore等人，2018年）。最近的一項進展涉及一種通用脫氨酶（GDE），它可以同時靶向脫氧腺苷和脫氧胞苷，從而實現更高效和更簡潔的基因多樣化系統（Mengiste等人，2024年；Neugebauer等人，2023年）。然而，盡管有這些先進的突變方法，仍然存在一個主要瓶頸：缺乏高效的篩選和富集所需性狀的手段（Li等人，2025年；Yang等人，2025年）。對于IFS而言，缺乏一種高通量方法來鑒定抗反饋突變體仍然是一個關鍵障礙。因此，開發創新的篩選策略對于充分利用定向進化來工程化抗反饋的IFS至關重要。
基于微滴的高通量篩選是一種強大的工具，用于發現高性能酶，它依賴于具有高靈敏度和特異性的生物傳感器產生的熒光信號（Yang等人，2025年；Zhang等人，2025年）。最近的進展表明，生物傳感器引導的進化在優化代謝途徑和緩解生產瓶頸方面是有效的（Li等人，2025年；Moon等人，2025年）。然而，由于染料木黃酮與其前體（2’S）-naringenin結構高度相似，開發針對染料木黃酮的生物傳感器一直具有挑戰性，這復雜化了特定信號識別（Chao等人，2023年）。一個有前景的解決方案是從根瘤菌中挖掘轉錄因子，因為根瘤菌天然暴露于異黃酮中。例如，Bradyrhizobium japonicum的轉錄因子FrrA可以特異性結合染料木黃酮以解除轉錄抑制，但對（2’S）-naringenin無反應，使其成為專用染料木黃酮生物傳感器的理想候選者（Wenzel等人，2012年；Werner等人，2022年）。然而，仍然存在一個關鍵的設計挑戰：在篩選抗反饋的IFS突變體時，培養基中必須存在外源染料木黃酮以施加抑制壓力。因此，生物傳感器需要精確調節靈敏度，以區分基礎背景水平和表明酶活性增強的染料木黃酮濃度。這需要對生物傳感器的動態范圍進行嚴格控制，以最小化背景熒光并確保準確篩選。
在這里，我們提出了一種結合了優化生物傳感器、連續定向進化和液滴微流控技術的綜合工作流程，用于鑒定抗反饋的TpIFS突變體（圖1）。為了確保高效篩選，構建了一種具有最小背景干擾的E. coli染料木黃酮生物傳感器。隨后，使用T7RNAP-GDE1嵌合體對TpIFS進行了連續定向進化，構建了一個高質量的突變體文庫。利用該系統以及T7RNAP-GDE1嵌合體，成功分離出了抗反饋突變體TpIFSM6。此外，通過相互作用分析和分子動力學模擬闡明了這種抗性的結構基礎。這項工作建立了一種穩健的體內選擇策略，為抗反饋酶的高通量進化提供了可擴展的解決方案。
化學物質和試劑
使用E. coli DH5α進行質�？寺�，而E. coli BL21(DE3)及其衍生物作為表達宿主。微生物培養使用Luria-Bertani（LB）培養基。培養基中的氨芐西林、氯霉素、卡那霉素、壯觀霉素、l-阿拉伯糖、異丙基β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）和鼠李糖均購自Sangon Biotech（上海，中國）。所有基因操作程序均遵循T4 DNA連接酶、限制性內切酶提供的說明
染料木黃酮對TpIFS的非競爭性抑制
為了構建從前體（2’S）-naringenin到染料木黃酮的生物合成途徑，選擇了來自Trifolium pratense的TpIFS和來自Catharanthus roseus的細胞色素P450還原酶（CrCPR），因為這些成分在E. coli中表現出高活性（Chemler等人，2010年；Wang等人，2022a年）。（2’S）-naringenin經歷IFS催化的2-羥基化和芳基遷移，生成不穩定的中間體2,4′,5,7-四羥基黃酮，隨后在E.中自發脫水
結論
本研究開發了一種基于生物傳感器的連續定向進化平臺，以克服異黃酮生物合成中的關鍵反饋抑制瓶頸。通過將體內突變與響應染料木黃酮的生物傳感器相結合，我們將染料木黃酮濃度轉化為正相關的熒光信號，實現了超高效通量的液滴分選，有效克服了皮升級檢測中的技術挑戰。一個關鍵的創新是
CRediT作者貢獻聲明
王哲：撰寫——原始草稿、可視化、形式分析、數據管理。趙丹山：撰寫——審閱與編輯、方法學。Ghada Said Baghdady：撰寫——審閱與編輯。王繼遠：形式分析。戴一強：可視化、數據管理。徐偉民：形式分析。王道英：形式分析。王月彤：方法學、資金獲取、形式分析。夏秀東：方法學、資金獲取、形式分析。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文報告工作的財務利益或個人關系。
致謝
我們感謝國家自然科學基金（項目編號：22478169 和 22508192）、國家重點研發計劃（項目編號：2024YFA0918000）以及江蘇省自然科學基金（項目編號：BK20231392 和 BK20230381）的財政支持。同時，我們也感謝Deggendorf理工學院BITZ轉化實驗室的Fidelis Azi博士在潤色和修訂手稿方面提供的幫助。
