《Chemistry and Physics of Lipids》：Priming with humic acid nanoparticles reduces copper cytogenotoxicity in hydroponic culture of wheat seedlings
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納米腐殖酸預(yù)處理通過增加小麥根系細(xì)胞外陷阱系統(tǒng)（RET）的細(xì)胞數(shù)量及分泌的蛋白質(zhì)和DNA含量，顯著降低銅的細(xì)胞遺傳毒性，表現(xiàn)為根尖分生區(qū)異常分裂細(xì)胞減少和銅積累量下降。
Natalia Gennadievna Menzyanova | Cathrine Kessler (Ekaterina Igorevna Shishatskaya) | Natalia Viktorovna Oreshkova | Aleksei Sergeevich Dorokhin | Svetlana Alekseevna Pyatina
西伯利亞聯(lián)邦大學(xué)，Svobodnyi大街79號(hào)，克拉斯諾亞爾斯克，660041，俄羅斯
摘要
隨著土壤生態(tài)系統(tǒng)中重金屬的人為污染日益嚴(yán)重，有必要培育出對(duì)金屬具有抗性的植物品種，包括農(nóng)作物。目前，“啟動(dòng)效應(yīng)”（priming）被廣泛用于這一目的。該技術(shù)基于誘導(dǎo)植物預(yù)先適應(yīng)環(huán)境的能力，從而提高其對(duì)后續(xù)各種壓力因素的耐受性。本研究探討了啟動(dòng)劑誘導(dǎo)的根際細(xì)胞外捕獲（RET）系統(tǒng)中的預(yù)先適應(yīng)機(jī)制對(duì)水培小麥幼苗中銅的細(xì)胞遺傳毒性的影響。實(shí)驗(yàn)使用了不同平均直徑的腐殖酸納米顆粒（nHA，分別為68納米和6.5納米，濃度為100毫克/升）作為啟動(dòng)劑。結(jié)果表明，nHA能夠增加根際細(xì)胞（BC）的數(shù)量以及RET基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和細(xì)胞外DNA（exDNA）的含量。此外，nHA處理顯著降低了銅的細(xì)胞遺傳毒性（濃度為31 × 10^?5 M）：根際細(xì)胞的數(shù)量和存活率更高，而根尖中的銅含量以及根尖分生組織中具有有絲分裂異常的細(xì)胞數(shù)量均低于未經(jīng)過nHA處理的對(duì)照組。這些發(fā)現(xiàn)表明，RET系統(tǒng)中的預(yù)先適應(yīng)機(jī)制在提高根系對(duì)土壤污染物的耐受性方面起著關(guān)鍵作用。
引言
工業(yè)化與城市化的加速、農(nóng)業(yè)對(duì)含銅殺菌劑的依賴以及未經(jīng)處理或部分處理的廢水在灌溉系統(tǒng)中的使用，是全球土壤生態(tài)系統(tǒng)受到重金屬污染的主要原因。據(jù)報(bào)道，全球有超過500萬地區(qū)的土壤受到重金屬污染。Nemerow綜合污染指數(shù)分析顯示，低污染農(nóng)田僅占可耕地總面積的14.07%（Yang等人，2022年）。重金屬污染的總經(jīng)濟(jì)影響估計(jì)每年超過100億美元（He等人，2015年）。重金屬的積累會(huì)降低土壤生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性、作物產(chǎn)量，并增加人類患各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)（Karimi等人，2021年；Poggere等人，2023年）。
在重金屬中，銅被認(rèn)為是對(duì)植物根系最具毒性的之一（Shabbir等人，2020年）。由于銅在礦物和有機(jī)組分中的特異性吸收，它傾向于沉積在表土層，并主要在植物根部積累（Rehman等人，2019年；Mir等人，2021年）。過量的銅暴露會(huì)引發(fā)根系的多種毒性反應(yīng)，例如活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的氧化損傷、增殖信號(hào)傳導(dǎo)和激素穩(wěn)態(tài)的紊亂（Rather等人，2020年；Farid等人，2021年；Li等人，2022年；Trentin等人，2022年），以及根尖分生組織中具有有絲分裂異常的細(xì)胞數(shù)量增加（Macar O等人，2020年；Macar T. K.等人，2020年；Liman等人，2021年）。這些變化會(huì)導(dǎo)致根系和地上部分的生長發(fā)育異常，從而降低作物產(chǎn)量。因此，培育出對(duì)金屬具有抗性的植物品種對(duì)于農(nóng)業(yè)技術(shù)和土壤修復(fù)具有重要意義。
目前，化學(xué)啟動(dòng)效應(yīng)被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)金屬抗性植物表型工程化（無需基因改造）的最有前景的方法之一。這一現(xiàn)象基于啟動(dòng)劑誘導(dǎo)的植物各種功能系統(tǒng)的表觀遺傳變化。這些變化（即預(yù)先適應(yīng)）決定了植物對(duì)后續(xù)壓力因素的耐受性（Tan等人，2022年；Harris等人，2023年；Zhang等人，2024年）。例如，5-氨基苯丙氨酸（5-aminolevulinic acid）的啟動(dòng)處理可以促進(jìn)番茄植株形成對(duì)有毒濃度銅具有抗性的表型（Kaya等人，2023年）。
銅對(duì)根系的毒性取決于根際代謝組，即根際代謝產(chǎn)物的數(shù)量和性質(zhì)（Rehman等人，2019年；Chen等人，2022年；Trentin等人，2022年；Xu等人，2023年）。銅與根際代謝產(chǎn)物的螯合復(fù)合物的形成可以減少根細(xì)胞對(duì)銅的吸收。因此，尋找能夠通過改變根際代謝組來減少銅從根際轉(zhuǎn)移到根部的過程及其細(xì)胞遺傳毒性的啟動(dòng)劑具有重要意義。
根際代謝組在很大程度上依賴于根際細(xì)胞（BC）的數(shù)量。根際細(xì)胞是一類代謝活躍的細(xì)胞，它們起源于根冠的薄壁組織，并在分化過程中從根冠表面脫離（Hawes等人，2000年）。根際細(xì)胞的一個(gè)顯著特征是具有高分泌活性，能夠分泌多種蛋白質(zhì)（酶、阿拉伯半乳聚糖蛋白、組蛋白）、DNA、果膠多糖、黃酮類化合物、多酚類化合物以及有機(jī)和無機(jī)酸（Hawes等人，2016年；Driouich等人，2019年；Ropitaux等人，2020年）。根際代謝產(chǎn)物構(gòu)成了一個(gè)高效的RET系統(tǒng)（Vincent等人，2020年），能夠捕獲各種化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)毒素（如重金屬、農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、納米顆粒）。因此，能夠增加根際細(xì)胞數(shù)量及其分泌活性的化合物可能有助于培育出對(duì)金屬具有抗性的根系表型。在水培小麥幼苗實(shí)驗(yàn)中，腐殖酸納米顆粒被證明可以劑量依賴性地增加根際細(xì)胞的數(shù)量以及RET基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和exDNA含量（Menzyanova等人，2023年）。基于此，本研究提出了以下假設(shè)：nHA啟動(dòng)誘導(dǎo)的根際細(xì)胞-RET系統(tǒng)變化可以降低銅對(duì)根系的細(xì)胞遺傳毒性。
1) 在含有銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不進(jìn)行nHA處理；
2) 先進(jìn)行nHA處理，然后再在含有銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
3) 在不含銅和nHA的蒸餾水中培養(yǎng)（對(duì)照組）。
穩(wěn)定的nHA水分散液由Biotech LLC（俄羅斯克拉斯諾亞爾斯克）提供。Biotech LLC按照Selyanina等人（2021年）描述的方法制備了nHA。具體步驟包括：使用0.1 N NaOH從泥炭中提取腐殖物質(zhì)，持續(xù)24小時(shí)（無需加熱），過濾后用鹽酸（pH 2.0）沉淀，并通過離心分離。為了獲得不同粒徑的納米分散液，對(duì)分離出的腐殖酸進(jìn)行了電化學(xué)處理。
在含有銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，根部銅含量呈劑量依賴性增加。當(dāng)培養(yǎng)基中的銅濃度分別為15.5 × 10^?5 M和31 × 10^?5 M時(shí)，根生物量中的銅含量分別是對(duì)照組的19倍和43倍（圖1a）。
銅在根生物量中的積累引發(fā)了氧化應(yīng)激。在培養(yǎng)基中銅濃度為15.5 × 10^?5 M和31 × 10^?5 M時(shí)，MDA含量分別增加了2.5倍和3倍。
根尖的根際細(xì)胞來源于根冠的薄壁組織。在分化過程中，根際細(xì)胞從根冠表面脫離并在根際環(huán)境中繼續(xù)發(fā)揮作用。它們在根系適應(yīng)各種非生物因素（如水分不足和高濃度植物毒素）的過程中起著關(guān)鍵作用。根際細(xì)胞的代謝產(chǎn)物對(duì)根系抗性表型的形成具有重要貢獻(xiàn)。
在含有nHA的培養(yǎng)基中萌發(fā)的小麥幼苗表現(xiàn)出較低的銅細(xì)胞遺傳毒性。與未進(jìn)行nHA處理的對(duì)照組相比，根尖分生組織中具有有絲分裂異常的細(xì)胞數(shù)量減少，而存活的根際細(xì)胞數(shù)量增加。因此，可以在含有nHA的培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)，這有助于促進(jìn)銅抗性根系表型的形成。
Natalia Gennadievna Menzyanova：撰寫初稿、驗(yàn)證結(jié)果、確定研究方法、構(gòu)建研究概念。
Cathrine Kessler (Ekaterina Igorevna Shishatskaya：驗(yàn)證結(jié)果、監(jiān)督研究過程、項(xiàng)目管理。
Natalia Viktorovna Oreshkova：撰寫文本、進(jìn)行修訂與編輯、協(xié)調(diào)研究資源、制定研究方法。
Aleksei Sergeevich Dorokhin：撰寫文本、進(jìn)行修訂與編輯、協(xié)助數(shù)據(jù)可視化。
Svetlana Alekseevna Pyatina：撰寫初稿、協(xié)助數(shù)據(jù)可視化、開展實(shí)驗(yàn)研究、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
所有作者均同意參與本研究并同意發(fā)表研究成果。
本研究得到了俄羅斯聯(lián)邦科學(xué)與高等教育部（項(xiàng)目編號(hào)：FWES-2026-0006）的資助。
作者們沒有需要披露的財(cái)務(wù)或非財(cái)務(wù)利益關(guān)系。
作者感謝西伯利亞聯(lián)邦大學(xué)的共享使用中心提供的支持，特別是N. V. Maznyak博士的幫助。
